高產(chǎn)酸性β-葡萄糖苷酶的優(yōu)良本土酵母菌株篩選、鑒定及酶學性質分析

葡萄酒釀造中，非釀酒酵母(non-Saccharomyces cerevisiae)是有別于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的一大類酵母菌，它們廣泛存在于葡萄園土壤、果實表皮和釀酒過程中，主要包括有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、畢赤酵母屬(Pichia)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、假絲酵母屬(Candida)和伊薩酵母屬(Issatchenkia)等[1-3]。其中，一些非釀酒酵母具有獨特的代謝通路和較強的酶活力，可以降低酒精的生成，增加甘油、萜烯和酯類含量，釋放甘露糖蛋白或多糖改善口感，增強顏色穩(wěn)定性[4]。利用一些非釀酒酵母的優(yōu)勢使其在受控的條件下參與或輔助葡萄酒釀造，能夠對葡萄酒的風味產(chǎn)生積極影響[4]。

與釀酒酵母相比，一些非釀酒酵母能夠代謝產(chǎn)生大量的β-葡萄糖苷酶[5]。β-葡萄糖苷酶作為一種纖維素類水解酶能夠水解糖苷結合態(tài)物質中的糖苷鍵釋放香氣物質，促進一些萜烯類和C13-降異戊二烯類物質的產(chǎn)生，從而增加葡萄酒的花香、果香和堅果香，對于改善或增強葡萄酒的風味復雜性有重要作用[6-7]。JOLLY等[8]報道了畢赤酵母屬(Pichia)酵母菌株具有代謝產(chǎn)生高β-葡萄糖苷酶活力的潛力；KONG等[9]將具有高β-葡萄糖苷酶活力的發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans)和膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)胞外酶添加到黑比諾葡萄酒中，明顯增加了酒體的花果香氣。然而，傳統(tǒng)的釀酒條件(如高濃度糖、高酒精度、高濃度SO2和低pH值)可能會抑制發(fā)酵體系中β-葡萄糖苷酶活力，導致其無法充分水解糖苷鍵[9]。研究表明，酵母菌的分布與地理位置和氣候條件等密切相關[10]。目前，世界上許多著名葡萄酒產(chǎn)地的本土酵母菌已被廣泛研究。我國酵母資源豐富，為改善葡萄酒的香氣，促進產(chǎn)區(qū)葡萄酒風土表達，特別是對于一些特色酒莊，應用高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的本土酵母來生產(chǎn)具有獨特風格的葡萄酒是一條重要途徑。因此，篩選來自本土高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶且耐受性優(yōu)良的非釀酒酵母菌株對提高葡萄酒香氣具有重要的意義。

本文以452株本土非釀酒酵母菌為實驗材料，根據(jù)其發(fā)酵能力、產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力、耐受性等進行了篩選研究，并進一步分析了上述菌株的β-葡萄糖苷酶酶學性質，旨在得到具有高產(chǎn)酸性β-葡萄糖苷酶及對葡萄酒生境耐受性優(yōu)良的非釀酒酵母菌株，并為其進一步開發(fā)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

1.1.1 實驗材料

商業(yè)釀酒酵母活性干粉(Vintage Red，SC-VR)，意大利Enartis公司；452株本土非釀酒酵母，分離自賀蘭山東麓和河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)，保藏于甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，菌株編號分別為GS1～GS65、GC66～GC209、GC301～GC335、NM210～NM240、ZC241～ZC300、ZX336～ZX344、BF345～BF361。

YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：無水葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10。

YPD固體培養(yǎng)基：在YPD液體培養(yǎng)基基礎上加入20 g/L瓊脂。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：七葉苷3，檸檬酸鐵0.5，NaCl 2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 1，瓊脂20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，NH4 NO3 3，KH2PO4 4，MgSO4·7H2O 0.5，吐溫-80 10。

所有培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 主要試劑

偏重亞硫酸鈉、酒石酸、無水乙醇、無水葡萄糖、果糖、蔗糖、對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，p-NPG)，上海源葉生物科技有限公司；ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3、CuSO4·5H2O、CaCl2、CoSO4·5H2O、Ni2SO4、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、麥芽糖，上海中秦化學試劑有限公司；酵母基因組DNA提取試劑盒AD1900，北京索萊寶科技有限公司；PEG 20000透析袋，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-150-II生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；H2050R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計，美國Thermo Scientific公司；1510酶標儀，美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化

保藏菌種分別活化，挑取單菌落于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h后，以2%的接種量于YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2次后進行試驗。

1.2.2 發(fā)酵能力試驗

參考CAPECE等[11]的方法，采用CO2失重法進行菌株發(fā)酵能力的測定，并略做修改。將供試菌株菌懸液按2%的接種量接種于裝有YPD液體培養(yǎng)基(8 mL)的無菌樣品瓶(12 mL)中，用無菌橡膠塞密封，并插入一次性無菌針頭進行排氣，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每隔12 h使用電子天平(可精確稱量至0.000 1 g)進行稱重并記錄數(shù)據(jù)，以SC-VR作為對照。

1.2.3 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的初篩

參考馬得草等[12]的方法，取180 μL已滅菌的β-葡萄糖苷酶初篩培養(yǎng)基加入到96孔培養(yǎng)板中，接入供試菌株菌懸液20 μL，于28 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)顏色等級初步判定酶活力大小，深棕色表示高產(chǎn)、淺棕色表示中產(chǎn)、灰綠色表示低產(chǎn)、無色表示不產(chǎn)。

1.2.4 耐受性試驗

參照吳健等[13]的方法進行測定。以YPD液體培養(yǎng)基為基礎，分別將葡萄糖質量濃度梯度設為150、200、250、300、350 g/L；SO2質量濃度(以偏重亞硫酸鈉的形式添加)梯度設為50、100、150、200、250 g/L；酒精體積分數(shù)梯度設為3%、6%、9%、12%、15%；pH值梯度設為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5；均以2%接種量接種供試菌株菌懸液，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，于600 nm處用酶標儀測定吸光值。

1.2.5 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的復篩

將優(yōu)選出的非釀酒酵母菌株于YPD培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)2次后，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h后，以10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min，28 ℃的搖床條件下培養(yǎng)72 h。

參照李愛華等[14]的方法制備粗酶液，略做修改。取發(fā)酵液于轉速為8 000 r/min、溫度為4 ℃的條件下離心15 min，收集上清液，用80%飽和度的硫酸銨鹽析，4 ℃下靜置過夜，離心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)收集沉淀，用等體積乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=5.0)溶解，再用PEG 20000進行透析，得到粗酶液并測定粗酶液酶活力大小，篩選出較高酶活力的菌株。

酶活力測定參照馬得草等[12]的方法進行。β-葡萄糖苷酶活力單位(U)定義為：40 ℃下1 min內催化生成1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量。

1.2.6 優(yōu)選菌株酶學性質分析

最適反應溫度的測定：參照孔利華等[15]的方法，并略做修改。以p-NPG為底物，按照酶活力測定方法分別于10、20、30、40、50、60、70 ℃反應30 min，測定酶活力，確定β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度。

最適反應pH值的測定：參照孔利華等[15]的方法，并略做修改。以p-NPG為底物，按照酶活力測定方法將粗酶液用檸檬酸-磷酸緩沖液調節(jié)pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0于最適反應溫度下反應30 min，測定酶活力，確定β-葡萄糖苷酶的最適pH值。

金屬離子和酶抑制劑對酶活力的影響：參照劉洋等[16]的方法測定。按照酶活力測定方法，在反應體系中添加5 mmol/L的金屬離子(Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ca2+、Co2+、Ni2+)和體積分數(shù)為1%的酶抑制劑[EDTA、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、巰基乙醇和二甲基亞砜)]，在最適溫度和最適pH值下測定酶活力，以不添加金屬離子和酶抑制劑的反應酶液活力為100%，測定相對酶活力。

底物對酶活力的影響：參照劉洋等[16]的方法測定。按照酶活力測定方法，在反應體系中添加0.1 mol/L 的底物(葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖和纖維二糖)，在最適溫度和最適pH值下測定酶活力，以不添加任何糖的反應酶液活力為100%，測定相對酶活力。

1.2.7 優(yōu)選菌株的菌屬鑒定

使用酵母基因組DNA提取試劑盒AD1900提取上述篩選獲得的菌株DNA，由北京擎科生物科技有限公司進行26S rDNA D1/D2區(qū)域序列測序。測序結果利用NCBI數(shù)據(jù)庫與目的酵母屬序列進行Blast同源性比對，從而鑒定篩選菌株種屬。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個試驗數(shù)據(jù)均獨立進行3次，取平均值。采用Excel 2010和Origin 9.0進行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 菌株的發(fā)酵能力分析

酵母酒精發(fā)酵過程伴隨著CO2的產(chǎn)生，因此利用CO2失重法即可評價菌株的酒精發(fā)酵能力[11]。圖1顯示了452株試驗菌株CO2失重量的分布情況，其中商業(yè)釀酒酵母SC-VR的CO2失重量(72 h)可達0.63 g/100mL，而供試的非釀酒酵母菌株CO2失重量>0.63 g/100mL的有83株，通常釀酒酵母的發(fā)酵力明顯高于非釀酒酵母，結合釀酒酵母發(fā)酵能力為0.63 g/100mL，本試驗將CO2失重量大于釀酒酵母發(fā)酵能力的80%即0.51 g/100mL的菌株視為具有較好的發(fā)酵能力，共有221株，對其進行后續(xù)試驗。

圖1 試驗菌株發(fā)酵能力分布
Fig.1 Distribution of fermentation capacity of test strains

2.2 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的初篩

七葉苷顯色反應是判斷酵母菌株產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶活力高低的重要指標之一。如圖2所示，不同顏色等級代表了產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶活力的高低，通過對供試菌株進行顯色判定發(fā)現(xiàn)，不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株有78株(共221株)，低產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株有72株，中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株有37株，高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株有34株。

圖2 試驗菌株在七葉苷培養(yǎng)基上的顯色圖片及產(chǎn)酶等級分布
Fig.2 Distribution of color pictures and enzyme-producing grades of test strains on esculin medium

2.3 菌株的耐受性分析

發(fā)酵過程中，非釀酒酵母的生長受到諸多因素的影響，如葡萄汁含糖量、發(fā)酵溫度、酒精體積分數(shù)和SO2添加量等均會影響其生長。通過觀察菌株在YPD液體培養(yǎng)基中的生長情況和OD600的關系，可將其分為5種類型，其中OD600≥1.0時，菌株大量生長；0.5≤OD600<1.0時，菌株明顯生長；0.3≤OD600<0.5時，菌株生長；0.1≤OD600<0.3時，菌株微量生長；OD600<0.1時，菌株不生長。根據(jù)34株試驗菌株在YPD液體培養(yǎng)基中的生長情況顯示，菌株GC204、NM218、ZC278、ZC287、BF345、BF370在不同條件下均表現(xiàn)出較高的耐受性，表明這6株菌株在葡萄酒釀造中具有一定的應用潛力。

由圖3-A可知，菌株GC204、NM218、ZC278、ZC287、BF345、BF370在葡萄糖質量濃度為200 g/L時，其生長活性達到最大值。一般釀酒葡萄汁糖的最高質量濃度在300 g/L左右(以葡萄糖計)[17]，而試驗菌株能在350 g/L的高糖質量濃度下明顯生長，說明菌株具有良好的高糖耐受性。由圖3-B可知，隨著SO2質量濃度的增加，6株試驗菌株的細胞濃度均呈下降趨勢，但能夠在250 mg/L SO2的條件下明顯生長。由圖3-C可知，6株試驗菌株能夠在酒精體積分數(shù)為3%～6%的條件下明顯生長，當酒精體積分數(shù)超過9%時，僅有菌株NM218、BF370能夠明顯生長。由圖3-D可知，菌株GC204、NM218、ZC278呈現(xiàn)上升的生長趨勢，而菌株ZC287、BF345、BF370呈現(xiàn)先上升后下降的生長趨勢，說明前者可能為中性菌株，后者為弱酸性菌株。6株試驗菌株均能夠在pH值為2.5的條件下明顯生長，幾乎不受低pH值的影響，說明這6株試驗菌株具有良好的低pH耐受性。

A-葡萄糖濃度；B-SO2濃度；C-酒精體積分數(shù)；D-pH值
圖3 試驗菌株在不同條件下的耐受性分析
Fig.3 Tolerance analysis of the test strains under different conditions

2.4 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的復篩

通過測定6株供試菌株的β-葡萄糖苷酶活力(圖4)。結果表明，菌株GC204、NM218、BF345的酶活力顯著高于菌株ZC278、ZC287、BF370，分別為54.34、49.5、46.42 mU/mL。

2.5 β-葡萄糖苷酶酶學性質分析

溫度會影響酶催化反應的速度以及酶蛋白的穩(wěn)定性。由圖5-A可知，溫度為10～70 ℃時，菌株GC204、NM218、BF345的β-葡萄糖苷酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；反應溫度為40 ℃時，3株菌酶活力達到最大值，GC204為47.95 mU/mL，NM218為47.08 mU/mL，BF345為49.42 mU/mL；當溫度為70 ℃時，3株菌酶活降低了34.58%～39.11%。

pH值會影響酶的構象，還會影響酶與底物的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和穩(wěn)定性。由圖5-B可知，菌株NM218和BF345的β-葡萄糖苷酶最適pH值為4.0，是弱酸性酶，其酶活力分別為49.70、50.78 mU/mL；而菌株GC204的β-葡萄糖苷酶在pH值為7.0時的酶活力達到最大，為54.40 mU/mL，是中性酶。

金屬離子和酶抑制劑對菌株GC204、NM218、BF345的β-葡萄糖苷酶影響如圖5-C所示，濃度為5 mmol/L的Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+對3株菌的酶活力具有明顯的激活作用，促使酶活力上升了23.72%～70.72%，而Cu2+對酶活力具有明顯的抑制作用，酶活力下降了14.87%～32.89%。4種酶抑制劑對菌株GC204的β-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出明顯的抑制作用，酶活力下降了33.93%～45.41%，而4種酶制劑對NM218和BF345的β-葡萄糖苷酶的抑制效果不明顯，酶活力僅下降了2.71%～7.66%。

不同糖底物(葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖和纖維二糖)對菌株GC204、NM218、BF345酶活力的影響如圖5-D所示，9種糖底物對β-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出激活作用，其中纖維二糖對3株菌株的酶活力激活作用尤為明顯，將酶活力提高了25.67%～40.80%；葡萄糖、麥芽糖和蔗糖將菌株GC204的酶活力提高了10.43%～18.52%；而除纖維二糖以外的其他不同糖底物對NM218和BF345的酶活力激活效果不明顯。

圖4 試驗菌株β-葡萄糖苷酶活力
Fig.4 β-glucosidase activity of the test strain
注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

A-溫度；B-pH值；C-不同金屬離子及酶抑制劑；D-糖底物
圖5 溫度、pH值、不同金屬離子及酶抑制劑和糖底物對酶活力的影響
Fig.5 Effects of temperature, pH, different metal ions and enzyme inhibitors and sugar substrates on enzyme activity

2.6 優(yōu)選菌株的菌屬鑒定

葡萄酒發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值一般在3.5～4.5，所以選取具有弱酸性酶活力的菌株NM218和BF345進行下一步試驗。通過對其進行26S rDNA D1/D2測序,如表1所示。

表1 試驗菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域序列測序結果
Table 1 Sequencing results of the 26S rDNA D1/D2 region of the test strain

并利用NCBI數(shù)據(jù)庫對菌株NM218與Meyerozyma guilliermondii菌株進行Blast同源序列比對，其相似性為99.51%，因此，菌株NM218被鑒定為季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)。同時，比對菌株BF345與Hanseniaspora uvarum菌株序列，相似性為99.83%，因此，菌株BF345被鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)。

3 討論

酵母菌在葡萄酒釀造中具有重要作用，優(yōu)質葡萄酒的釀造依賴于優(yōu)良微生物菌種的開發(fā)利用。葡萄酒發(fā)酵初期的低pH、高糖、高SO2以及逐漸增高的乙醇體積分數(shù)這些環(huán)境因子能夠影響酵母菌群的生長動態(tài)，從而影響酒精發(fā)酵，因此酵母菌株對葡萄酒生境下的耐受性是決定其能否應用于葡萄酒釀造的重要前提條件。本研究通過篩選獲得1株季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)菌株NM218和1株葡萄汁有孢漢遜酵母(H. uvarum)菌株BF345，這2株菌均能夠在350 g/L葡萄糖、250 mg/L SO2、pH值2.5和6%乙醇體積分數(shù)的條件下生長，具有較好的耐受性。PERRUSQUA-LUEVANO等[18]研究發(fā)現(xiàn)的1株H.uvarum菌株能夠耐受350 g/L葡萄糖和100 mg/L SO2，劉曉柱等[19]發(fā)現(xiàn)的1株H.uvarum F119菌株能夠耐受300 mg/L的SO2質量濃度、pH值2.0和8%乙醇；這些結果雖然與本研究結果有一定的差異，但也說明H.uvarum菌株具有在葡萄酒生境下正常生長的潛力，但考慮其能夠耐受6%乙醇這一特性，在應用方面適合在釀酒前期使用。

高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母能夠增加揮發(fā)性化合物含量，從而提高葡萄酒的感官復雜性和某些發(fā)酵參數(shù)[20-21]。本研究中篩選得到的菌株NM218和BF345的β-葡萄糖苷酶活力可達49.5、46.42 mU/mL。尹薦等[22]發(fā)現(xiàn)膠紅酵母和發(fā)酵畢赤酵母有較高的β-葡萄糖苷酶活力，分別為41.81、30.42 mU/mL。因此，本文篩選得到的菌株NM218和BF345具有較高的β-葡萄糖苷酶活力。

微生物源β-葡萄糖苷酶的酶學性質因菌種、菌株不同而有較大差異，其適用范圍也隨之不同。已報道的微生物源β-葡萄糖苷酶最適反應pH值為3.5～7.0，以pH值4.0～6.0常見；最適反應溫度在40～70 ℃，常為55 ℃，部分為65～70 ℃[23-24]。工業(yè)葡萄酒發(fā)酵過程中原料葡萄汁的pH值多在3.5～4.5，酒精發(fā)酵過程的溫度控制在30～35 ℃[25]，因此，要充分利用酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶，則對其最適反應溫度和pH值提出了要求。DA SILVA等[23]研究發(fā)現(xiàn)Pichia guilliermondii G1.2產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶pH3.5～5.5及溫度55 ℃時活性最高；王彩肖[26]研究發(fā)現(xiàn)3株自選酵母和5株商用酵母中β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為50 ℃；來自吐魯番盆地的5株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株在pH 5.0時表現(xiàn)出高活性[27]。這些菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶尚無法滿足實際葡萄酒釀造的需求。本研究中菌株NM218和BF345的酶活力最適反應溫度為40 ℃，最適pH值為4.0，能基本滿足在釀酒期間的溫度和低pH值條件，說明菌株具有在葡萄酒發(fā)酵過程發(fā)揮作用的潛力。

4 結論

本研究從452株本土非釀酒酵母菌株中初步篩選獲得了34株發(fā)酵能力較好且高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。經(jīng)耐受性試驗發(fā)現(xiàn)，菌株GC204、NM218、ZC278、ZC287、BF345、BF370對葡萄糖、SO2、酒精度和pH值均具有較好的耐受性。同時，復篩及酶學性質分析表明，菌株NM218和BF345具有較高的β-葡萄糖苷酶活力，分別為49.5和46.42 mU/mL，酶促反應最適溫度為40 ℃，最適pH值為4.0；濃度為5 mmol/L的Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+對2種菌株的β-葡萄糖苷酶活力均具有明顯的激活作用；Cu2+具有明顯的抑制作用；纖維二糖對2種菌株的β-葡萄糖苷酶激活效果明顯，使酶活力提高30.18%～40.80%。通過26S rDNA D1/D2測序比對，鑒定菌株NM218和BF345分別為季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)和葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)。