不同來源蛋白對小鼠衰老和腸道菌群的影響

自2000年以來，老齡化已成為中國的主要公共衛(wèi)生問題，預計到2050年老齡人口將占總人口的35%[1]。通過改善飲食來探索延緩衰老的方法，從而提高老齡化人口的壽命和生活質量逐漸成為研究熱點。

為了解決基于飲食調節(jié)改善衰老狀態(tài)的問題，首先需要明確人體組織隨著年齡增長會出現(xiàn)的變化。從心理層面來說，老年人由于自身存在感的降低，易產生心理負擔，導致抑郁、失落、狐獨感[2]。從生理層面看，老年人體內肌肉含量下降，骨骼逐漸變得脆弱，易發(fā)生骨質疏松等問題[3]?？谇谎例X脫落，吞咽食物能力受損。研究發(fā)現(xiàn)健康的老年人與年輕人相比，胃蛋白酶以及十二指腸液中的脂肪酶，胰凝乳蛋白酶和淀粉酶的含量顯著降低[4]，影響了蛋白質的消化吸收。結腸運轉時間會隨著年齡的增長而延長，導致腸道疾病的發(fā)生，例如便秘和糞便失禁[5]。這些變化可能會影響老年人對食物的選擇和消化，因此，直接或間接地導致老年人腸道中微生物群的改變。老年人腸道菌群最大的特點是碳水化合物發(fā)酵菌群丟失，而蛋白質水解菌群增加[6]。因此，一些與不健康衰老相關的兼性厭氧菌，如腸桿菌，鏈球菌，腸球菌富集[4]，而有益菌如雙歧桿菌的豐度減少[7]。

結合菌群及衰老機體的變化，我們發(fā)現(xiàn)膳食蛋白質對于維持老年人的健康來說至關重要。動物蛋白和植物蛋白中氨基酸含量不一致，消化率也不同。乳清蛋白和大豆蛋白被認為是動植物蛋白中的“完全蛋白質”。研究表明，相比于其他蛋白來說，乳清蛋白是老年人最易消化的蛋白質[8]，但也有研究表明增加植物蛋白的攝入可以延緩不健康衰老[9]。因此本研究選用乳清蛋白和大豆蛋白，以及二者混合的蛋白，探究長期攝入不同來源蛋白對自然衰老小鼠骨骼和肌肉等衰弱情況及胃腸道的影響，明確何種蛋白質更適合逐漸衰老小鼠的機體，為膳食干預改善健康衰老的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PB3002-N電子天平，梅特勒托利多公司；DWS Multiskan GO多功能酶標儀，賽默飛公司；Pannormic MIDI數(shù)字切片掃描儀，3DHISTCH公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；抓力儀，濟南益延科技有限公司；Quantum GX Micro-CT，珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司。

環(huán)保型GD固定液，賽維爾生物科技有限公司；血清P物質(substance P，SP)、胃泌素(gastrin，GAS)、胃動素(motilin，MTL)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、生長抑素(somatostatin，SS)ELISA試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；乳清蛋白、大豆蛋白，上海創(chuàng)賽有限公司；飼料配方見表1，由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司提供。

表1 不同飼料中主要營養(yǎng)元素和供能比 單位：%

Table 1 Main nutrient elements and energy supply ratio in different feeds

注：-表示無

1.2 動物實驗設計

動物實驗方案及實驗操作均由江南大學動物倫理委員會批準(JN.No20200430c0500220[17])。本實驗將18只C57BL/6J小鼠[雌性，17月齡，體重30 g左右，SPF級，斯貝福(北京)生物技術有限公司]飼養(yǎng)在江南大學動物實驗中心的屏障內(無特定病原體，20～26 ℃，40%～70%濕度，12 h明暗循環(huán))。

適應1周后，將小鼠隨機分為3組(n=6)，飼喂供能比相同的混合蛋白或單一蛋白飼料24周，飼料按美國AIN-93M標準添加其他營養(yǎng)元素，所有飼料的熱量和脂肪水平相同，詳細分組見表2。

表2 實驗分組情況
Table 2 Experimental groups

實驗期間每周測定小鼠體重，統(tǒng)計攝食量。實驗結束前，于上午收集每只小鼠糞便于無菌離心管中，統(tǒng)計8∶00～13∶00這一時間段內的排便量。收集的糞便部分用于含水量的測定，部分于-80 ℃條件下貯存，用于腸道菌群分析。

1.3 衰老評分

處死小鼠前，參考FERIDOONI等[10]的方法略作修改，對每只衰老小鼠的脆弱程度進行評分，共包括對27個變量的評估(表3)。根據這些變量計算虛弱指數(shù)(frailty index，F(xiàn)I)分數(shù)：對于每個參數(shù)，0分代表無缺陷，0.5分代表輕度缺陷，1分代表嚴重缺陷。

表3 C57BL/6J小鼠衰老的臨床體征
Table 3 Clinical signs in aging C57BL/6J mice

注：將27個參數(shù)中每個參數(shù)的得分相加，再除以測量的參數(shù)總數(shù)，得出每只動物的FI分數(shù)在0～1

1.4 抓力、步態(tài)速度和繩索實驗

處死小鼠前，參考SELDEEN等[11]的方法進行小鼠抓力測試，使用抓力儀重復5次實驗并記錄最大值。

步態(tài)速度分析是在一個8 cm(寬)×12 cm(高)×1 m(長)的通道上進行的，通道通向一個黑暗的“安全屋”盒子[12]。重復3次實驗，記錄小鼠從通道一端走進盒子中最快的1次所需要的時間。

繩索實驗參考INGRAM等[13]的方法，簡而言之，將小鼠放在長60 cm，直徑1.5 cm的繩子上，如果在連續(xù)5次實驗中至少有1次實驗，該小鼠在60 s的時間內沒有掉下或走到了繩子的任何一端，對這只小鼠來說該實驗是成功的。

1.5 肌肉含量及其組織學形態(tài)和股骨密度及其成像

取小鼠右小腿腓腸肌、比目魚肌和脛骨前肌稱重。取其中的脛骨前肌固定在環(huán)保型GD固定液中，石蠟包埋，5 μm厚切片，蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色。使用病理切片掃描儀觀察染色切片，隨機采集圖像。

同時取小鼠右大腿股骨固定在4%多聚甲醛溶液中，骨顯微成像(micro-CT)前取出，用生理鹽水沖洗3遍,同時測量骨密度。

1.6 小腸推進率及血清胃腸調節(jié)肽測定

小腸推進率實驗采用LEE等[14]的方法，稍作修改。給每只小鼠灌胃墨汁0.2 mL，20 min后處死小鼠。解剖取出小腸，測量墨汁推進的長度和整個小腸的長度，計算小腸推進率。

血清中的SP，GAS，MTL，VIP，SS利用ELISA試劑盒進行測定。

1.7 基于16S rRNA擴增測序分析腸道菌群的變化

糞便中的DNA利用FastDNA Spin Kit for Feaces進行提取，然后使用V3～V4區(qū)特異性引物進行PCR擴增，最后利用BIOMIGA純化試劑盒進行純化。將擴增子文庫以等摩爾量混合，然后在Illumina MiSeq高通量測序平臺(Illumina，San Diego，CA，USA)上進行測序。測序數(shù)據經過質控，基于QIIME 2(開源，https://view.qiime2.org/)分析16S rRNA序列數(shù)據[15]。菌群的β多樣性分析通過非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)的方法進行[16]。通過線性判別分析(liner discriminant analysis effect size，LEfSe)的方法對組間差異菌群進行分析[17]。

1.8 數(shù)據分析

本文中數(shù)據統(tǒng)計學分析采用LSD和Duncan′s多變量檢驗對各組平均值的差異進行了分析。

2 結果與分析

2.1 不同來源蛋白質對體重、食物攝入量和衰老評分的影響

為監(jiān)測小鼠衰老過程中的基本健康狀況，每周采集體重和攝食量的數(shù)據。隨著年齡增大，每組小鼠體重都有不同程度的降低，其中大豆蛋白組降低幅度較小(圖1-a)。從每周食物攝入情況來看，混合蛋白組小鼠攝食量相對高，乳清蛋白組次之，大豆蛋白組最小(圖1-b)。小鼠的衰老程度通過脆弱指數(shù)進行表征，得分越高代表虛弱程度越高，機體衰老情況越嚴重。3組中大豆蛋白組得分最低，混合蛋白組最高(圖1-c)，因此，大豆蛋白組小鼠的衰老程度最低。

長期攝入大豆蛋白對衰老時期小鼠的體重具有維持作用，并且在整體衰老情況上有一定的改善。在一項長期的人群實驗中也發(fā)現(xiàn)增加植物蛋白的攝入可以降低衰老后的累積健康缺陷指數(shù)(代表老年人的衰弱情況)，并且植物蛋白質的攝入量與該指數(shù)呈負相關[9]。這可能是由于動植物蛋白質中的氨基酸組成不一致所導致。相比于乳清蛋白來說，大豆蛋白中蛋氨酸和支鏈氨基酸含量較低，研究表明長期限制蛋氨酸或者終身限制支鏈氨基酸的飲食或能改善代謝、延長壽命和延緩衰老相關疾病的發(fā)生[18-19]。

a-體重變化情況；b-攝食量比較；c-衰老評分比較
圖1 不同來源蛋白對小鼠衰老表征的影響
Fig.1 Effects of proteins from different sources on the aging characteristics in mice

2.2 大豆蛋白對老齡小鼠的肌肉和骨骼健康有益

衰老時機體會面臨肌肉含量下降，力量喪失；骨骼密度持續(xù)下降，易出現(xiàn)骨折等與肌肉和骨骼健康相關的問題。為探究不同來源蛋白對老年小鼠肌肉功能的影響，基于3個行為學實驗的結果，并結合肌肉在體內的比例以及切片進行判斷。繩索實驗結果顯示混合蛋白組、大豆蛋白組和乳清蛋白組小鼠成功的只數(shù)除上整組的數(shù)量得到繩索實驗的成功率，分別為40%、83.3%和83.3%。從行走速度上看各組之間無顯著性差異(圖2-a)，混合蛋白組小鼠抓力弱，大豆和乳清蛋白組的小鼠抓力則無顯著性差異(圖2-b)。為進一步解析衰老后小鼠肌肉的含量以及結構，通過肌肉含量及切片發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白組小鼠肌肉含量高，乳清蛋白組次之，混合蛋白組最低(圖2-c)。大豆蛋白組小鼠肌纖維排列明顯比其他兩組緊密，但是3組小鼠的肌肉組織中都有不同程度的脂肪異常堆積，其中混合蛋白組較為嚴重(圖2中黑色方框)，并且其部分肌纖維變形嚴重，被拉長而失去正常形態(tài)，另外兩組在部分肌纖維中出現(xiàn)脂滴堆積(圖2中黑色箭頭)，乳清蛋白組小鼠肌纖維還出現(xiàn)了粘連的情況(圖中黑色橢圓)(圖2-f)。

為探究不同來源蛋白對老年小鼠骨骼的影響，我們對小鼠大腿股骨進行顯微成像(圖2-e)。需要明確的是，老年小鼠骨頭中骨小梁數(shù)目降低，結構不完整。3組相比，在關節(jié)處沒有明顯差異，但大豆蛋白組小鼠股骨的皮質骨厚度更為均勻，并且骨密度也相對高(圖2-d)。

3組蛋白的攝入均不能改善衰老后肌肉組織中出現(xiàn)的部分肌纖維萎縮、形變以及脂肪異常堆積的現(xiàn)象。本研究表明，長期攝入大豆蛋白的小鼠肌肉組織相對較為健康，肌纖維排列依舊緊密，但這與文獻報道的結果不一致，文獻中的結果均集中在乳清蛋白或者乳清蛋白和大豆蛋白的混合物比其他蛋白質在更大程度上刺激肌肉蛋白質的合成[20-22]。但這些文獻大多集中在運動之后或者短時期的干預，缺乏對宿主的長時間膳食干預影響的結果。乳清蛋白因其更高的消化率，在短期內反應更加迅速，不能長期并有效地促進肌肉蛋白合成，而大豆蛋白是一種中間消化速率蛋白，這可能是導致本實驗的結果與文獻不一致的原因。本實驗從長遠影響的角度出發(fā)，更加契合自然衰老的實際情況。BLUM等[23]的研究表明膳食大豆蛋白對老年大鼠雌激素缺乏性骨丟失的骨骼有一定的保護作用，是通過增加或維持較高的骨形成率的方式發(fā)揮作用的。在長期的熱量限制飲食中，相比于酪蛋白，攝入大豆蛋白的大鼠有更好的骨質量和更高的骨形成水平[24]。本研究所用動物為老年雌性小鼠，故攝入大豆蛋白有助于改善骨骼健康。

a-步態(tài)速度；b-抓力測試；c-肌肉含量[以小腿肌肉質量(g)/體重(kg)表示]；d-骨密度；e-股骨顯微成像(micro-CT)；f-肌肉組織形態(tài) (HE染色，10×)，黑色方框顯示脂肪異常堆積，右下角為局部放大圖片(40×)，黑色箭頭指向肌纖維中的脂滴堆積，黑色橢圓顯示肌纖維粘連
圖2 不同來源蛋白對衰老小鼠肌肉和骨骼的影響
Fig.2 Effects of proteins from different sources on muscles and bones of aging mice
注：*表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 不同來源蛋白對胃腸道轉運功能無顯著影響

衰老時，由于機體消化系統(tǒng)的不良變化，對蛋白質的消化吸收能力下降，并且植物蛋白與動物蛋白的消化率也不一致。因此，探索何種蛋白質更適合衰老的機體時，則需要考慮它們對胃腸道功能的影響，胃腸道疾病如便秘是老年人容易出現(xiàn)的問題之一。基于便秘的指標，我們測定了小鼠糞便含水量、一段時間排便量和小腸墨汁推進率。結果顯示，混合蛋白和大豆蛋白組小鼠糞便含水量相對較高(圖3-a)，且相對來說大豆蛋白組排便量多(圖3-b)，小腸推進速度也相對較快，盡管各組之間并無統(tǒng)計學差異(圖3-c)。由于血清中胃腸調節(jié)肽的含量可影響腸道的運輸功能，其中SP，MTL和GAS分泌可以促進腸道蠕動，而VIP和SS分泌則會抑制腸道蠕動，因此測定了小鼠血清中胃腸調節(jié)肽的水平。大豆蛋白組小鼠血清中MTL含量顯著高于混合蛋白組，其他指標則無顯著性差異(表4)。整體結果顯示不同來源的蛋白質對衰老的胃腸道轉運功能無顯著的影響。

蛋白質含量的高低會影響腸道蠕動速度，高蛋白飲食減慢了腸道運輸功能[25]，但不同種類蛋白質或氨基酸對腸道運輸功能的影響未知。本研究中的飼料蛋白質含量正常，不同組別之間的蛋白質僅氨基酸組成有差異，且大豆蛋白和乳清蛋白均易于吸收，因此，這可能是3組蛋白飲食對小鼠腸道轉運功能影響無顯著性差異的原因。

a-糞便含水量；b-排便量；c-小腸推進率
圖3 不同來源蛋白對衰老小鼠胃腸道功能的影響
Fig.3 Effects of proteins from different sources on gastrointestinal function in aging mice

表4 血清中胃腸調節(jié)肽的變化 單位：ng/L

Table 4 Alterations of regulatory peptides of the gut in serum

注：實驗結果以“均值±標準偏差”表示；同一列中注不同字母的組別表示具有顯著性差異(P<0.05)，標注相同字母及未標注字母的組別之間不具備顯著性差異(P>0.05)

2.4 大豆蛋白可調節(jié)老化腸道微生物組成

腸道衰老的另一個重要變化是腸道菌群紊亂。衰老腸道菌群的特點是有益菌減少，有害菌和條件致病菌富集。為了研究不同來源蛋白質對衰老腸道微生物結構和組成的影響，我們利用16S rRNA擴增測序技術分析腸道菌群的變化。老年時期，腸道中Firmicutes的相對豐度增加，而Bacteroidetes的相對豐度降低，導致F/B值升高，在大豆蛋白組中尤為明顯。另外，大豆蛋白組Actinobacteria的相對豐度較高，而其他兩組Verrucomicrobia的相對豐度較高(圖4-a)?；讦炼鄻有灾械腛bserved 操作分類單元(operational taxonomic unit ，OUT)和Shannon指數(shù)，分別從OTU數(shù)量以及物種的豐度衡量組內菌群的α多樣性。結果發(fā)現(xiàn)，不同來源的蛋白質對腸道菌群的α多樣性無顯著的影響(圖4-c)。基于Bray-Curtis指數(shù)的NMDS方法分析組間菌群的β多樣性，發(fā)現(xiàn)3組小鼠的菌群結構存在顯著差異(P<0.05，圖4-d)。通過LEfSe對大豆蛋白與其他兩個組別間差異菌屬進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白組小鼠腸道菌群中Fournierella、Bifidobacterium和Alloprevotella較混合蛋白組高，而Marvinbryantia、Bifidobacterium、Fournierella、Romboutsia較乳清蛋白組高；混合蛋白組小鼠的優(yōu)勢菌屬則是Akkermansia，而Parabacteroides、Bacteroides、Rikenellaceze RC9 gut group是乳清蛋白組小鼠的優(yōu)勢菌屬(圖4-b)。通過單獨比較Bifidobacterium、Fournierella和Akkermansia的相對豐度，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白組小鼠腸道中Bifidobacterium和Fournierella的相對豐度最高，而Akkermansia的相對豐度較低(圖4-e)。

根據研究顯示，通過灌胃大鼠低聚半乳糖，對鈣、鎂的吸收和滯留、骨強度和骨密度均有一定的促進作用，而這些影響直接或間接歸因于盲腸pH值、盲腸內容物、壁重和雙歧桿菌數(shù)量的變化，與腸道菌群的變化密切相關[26]。一項關于青少年女性的人群實驗表明，攝入低聚半乳糖能夠增加體內鈣的吸收，有助于其骨骼健康，同時提高雙歧桿菌的比例[27]。因此推測長期食用大豆蛋白促進衰老小鼠中Bifidobacterium增加，是其骨量增加的原因之一。另外Fournierellah和Alloprevotella在大豆蛋白組小鼠的腸道菌群中富集，這些菌屬被認為有利于腸道菌群代謝物短鏈脂肪酸的產生[28]。短鏈脂肪酸在一定程度上可以調節(jié)體內脂肪和骨骼肌，當乙酸進入血液循環(huán)后會直接影響外周脂肪組織、肝臟和肌肉基質；而乙酸和丙酸則可能會減少骨骼肌中異位脂肪的貯存[29]。因此推測長期食用大豆蛋白促進衰老小鼠中調節(jié)短鏈脂肪酸菌群的增加，是其肌肉可以維持健康的原因之一。此外，Akkermansia被認為可以延緩衰老，延長壽命，實驗表明Akkermansia移植能夠顯著延長早衰小鼠的壽命，在不同模型中壽命延長均超過了10%[30]，表明攝入乳清蛋白對菌群的調控還是有一定益處的，但綜合來看，大豆蛋白對衰老的機體調節(jié)作用更為明顯和全面。

a-腸道菌群門水平的變化；b-差異菌屬比較(紅色、藍色、綠色分別代表大豆蛋白組、混合蛋白組和乳清蛋白組);c-菌群的α多樣性； d-菌群β多樣性；e-Bifidobacterium、Fournierella和Akkermansia相對豐度的變化
圖4 不同來源的蛋白對小鼠腸道菌群的影響
Fig.4 Effects of proteins from different sources on gut microbiota in mice
注：**表示具有顯著性差異(P<0.01)

3 結論

綜合來看，大豆蛋白可以維持衰老小鼠體重、肌肉和骨骼健康，調節(jié)衰老小鼠的腸道菌群結構和組成，同時增加腸道中Bifidobacterium和Fournierella有益菌的豐度，這些有益菌豐度的增加可能與肌肉骨骼健康密切相關。大豆蛋白的攝入更有利于改善衰老，同時結合腸道菌群的變化，可以為老年人的食品開發(fā)中選擇蛋白質的種類提供參考依據。