源自香糟大黃魚的紅酒糟優(yōu)勢菌特性及發(fā)酵能力研究

大黃魚享有“國魚”之美譽，2020年全國養(yǎng)殖量約25萬t，其中福建省產(chǎn)量約占全國總產(chǎn)量的81%[1]。發(fā)酵大黃魚是傳統(tǒng)加工產(chǎn)品，具有風(fēng)味獨特、利于保藏和便于運輸?shù)忍攸c[2]。紅酒糟具有福建省地方特色，含有發(fā)酵后未被利用的粗淀粉、粗蛋白及有機酸類等物質(zhì)，為釀紅曲酒的副產(chǎn)物，對人體健康和膳食均衡起到一定的作用[3]。香糟大黃魚由原料大黃魚和紅酒糟在密閉環(huán)境下發(fā)酵而成，傳統(tǒng)發(fā)酵多采用手工操作，存在人工經(jīng)驗依賴性強、發(fā)酵周期長、缺乏標準化等問題。目前，工業(yè)化生產(chǎn)中將紅酒糟與三去(去鱗、去鰓和去內(nèi)臟)魚體復(fù)合，采用層糟層魚、真空包裝、冷凍加工和冷鏈銷售等方式進行，基本未進行發(fā)酵，風(fēng)味多來自酒糟自身，難以呈現(xiàn)發(fā)酵魚特有風(fēng)味。因此，篩選優(yōu)勢微生物及分析其發(fā)酵能力，進一步采用現(xiàn)代生物和發(fā)酵工程等技術(shù)，通過強化發(fā)酵劑和優(yōu)化底物等手段，利用微生物間的相互作用使發(fā)酵產(chǎn)品更易消化吸收，以滿足消費者對產(chǎn)品營養(yǎng)、質(zhì)地、安全、風(fēng)味等更高的要求[4-5]。

發(fā)酵魚中優(yōu)勢菌群受產(chǎn)品類型、生產(chǎn)工藝和生態(tài)因子等影響，其種群類別和發(fā)酵特性均存在差異。ZENG等[6-7]從中國傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚中分離出2株具有抑菌及高酸化活性的植物乳桿菌，接種至魚糜進行發(fā)酵，產(chǎn)品具有較好的風(fēng)味；并從酸魚中分離酵母菌，探究其耐受性、蛋白水解和脂解活性，用其制作發(fā)酵劑提高了發(fā)酵效能和產(chǎn)品質(zhì)量。賀林娟等[8]將分離的發(fā)酵乳桿菌接種至糟制鰳魚中，采用接種發(fā)酵與傳統(tǒng)工藝相結(jié)合的方法，縮短了發(fā)酵周期的同時形成了優(yōu)質(zhì)風(fēng)味。混合菌種接種發(fā)酵效果優(yōu)于單一菌接種發(fā)酵[9]，其模擬自然發(fā)酵中多種微生物的協(xié)調(diào)作用，能夠更好地還原傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風(fēng)味特征。

本研究以源自香糟大黃魚中紅酒糟的優(yōu)勢菌株為對象，研究其生理生化、耐受性和碳源利用等基本特征，并以單一菌和復(fù)合菌協(xié)同紅酒糟接種至魚塊中，測定發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌動態(tài)與品質(zhì)變化，以期為香糟大黃魚發(fā)酵劑的制備和傳統(tǒng)發(fā)酵工藝優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酒糟樣品，采集于寧德市，命名為J。取得樣品后，貯存于無菌三角瓶中，低溫運輸至實驗室。新鮮大黃魚購自福建寧德某公司，層冰層魚，冷鏈運至上海，備用。

MRS、PDA培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；體積分數(shù)為3%過氧化氫酶溶液、葡萄糖產(chǎn)氣生化管、PCA培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乳酸(食品級)，鄭州高研生物科技有限公司；BUG培養(yǎng)基、FF-IF、IF-A接種液、GEN-III、FF、YT板，美國Biolog公司；微孔板，芬蘭Bioscreen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

濁度計，美國BIOLOG公司；Bioscreen C微生物生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen公司；MIR-153高精密度低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KDN-103F自動定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；Chroma Meter CR400色差計，日本Minolta公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物的分離純化及鑒定

1.3.1.1 微生物分離純化

取酒糟樣本10 g于無菌研缽中，加入90 mL生理鹽水，研磨勻漿后進行梯度稀釋，選取適宜的稀釋梯度進行涂布平板計數(shù)。菌落總數(shù)、乳酸菌分別采用PCA和MRS培養(yǎng)基，酵母菌和霉菌采用PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。按照菌落形態(tài)學(xué)進行分組計數(shù)，3代劃線分離，得到純菌株，4 ℃保藏待用。

1.3.1.2 微生物鑒定

BIOLOG鑒定：將純化后的菌株分別接種至BUG、MRS和PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至可接種狀態(tài)。校準各接種液透光率為100%；將細菌接種到IF-A中，調(diào)節(jié)透光率至90%～98%；霉菌接種至FF-IF中，調(diào)節(jié)透光率至73%～77%；酵母菌接種至無菌生理鹽水，調(diào)節(jié)透光率至45%～49%。將接種液分別加入96孔GEN-III、FF和YT鑒定板中，每孔100 μL，培養(yǎng)48 h后，采用BIOLOG微生物半自動鑒定儀鑒定。

分子鑒定：將占比高的菌株經(jīng)反復(fù)分離純化后進行鑒定。細菌鑒定：擴增分離菌株16S rDNA，通用引物：27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；酵母菌鑒定：擴增分離菌株26S rDNA的D1/D2區(qū)域，引物為NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。PCR反應(yīng)體系：Template(基因組DNA 20～50 ng/μL)×0.5 μL；10×Buffer(含Mg2+)×2.5 μL；dNTP(各2.5 mmol/L)×1.0 μL；酶×0.2 μL；F(10 μmol/L)×0.5 μL，R(10 μmol/L)×0.5 μL；加雙蒸水至25.0 μL；PCR循環(huán)條件：預(yù)變性(94 ℃，4 min)；30 cycle(94 ℃，45 s；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min)；修復(fù)延伸(72 ℃，10 min)；終止反應(yīng)(4 ℃，∞)。

1.3.2 菌株特性測定

1.3.2.1 菌株生理生化特征

使用無菌接種環(huán)挑起單菌落至液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)18～24 h，即為新鮮肉湯培養(yǎng)物，備用。

糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣測定：吸取50～80 μL新鮮肉湯培養(yǎng)物加入葡萄糖產(chǎn)氣微量西林瓶中，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，并按照其說明書對結(jié)果進行判讀。過氧化氫酶測定：使用無菌接種環(huán)挑取單菌落，使菌體置于體積分數(shù)3%H2O2溶液中，于30 s內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，否則為陰性。蛋白酶測定：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)10%脫脂奶粉，115 ℃滅菌20 min，倒平板凝固后于培養(yǎng)基上打孔，孔內(nèi)加入新鮮肉湯培養(yǎng)物，靜置培養(yǎng)觀察是否出現(xiàn)透明圈。脂肪酶測定：基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌后冷卻至80 ℃，加入質(zhì)量分數(shù)1%三丁酸甘油酯，倒平板凝固后于培養(yǎng)基上打孔，孔內(nèi)加入新鮮肉湯培養(yǎng)物，靜置培養(yǎng)觀察是否出現(xiàn)透明圈。

將短乳桿菌以1%接種量接種至未添加NaCl及添加2%、4% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，測定24 h的pH以評價產(chǎn)酸能力。NaCl和pH對短乳桿菌和釀酒酵母生長的影響中，NaCl質(zhì)量分數(shù)(2%、4%、6%、8%)，pH(3、5、7)；乳酸質(zhì)量分數(shù)梯度設(shè)置為1%、3%、5%、7%。依照各因子配制相應(yīng)的MRS和PDA無菌接種液，微孔板中每孔加入180 μL接種液，取約104CFU/mL濃度的菌懸液20 μL接種至孔中，平行實驗數(shù)為5，以無菌接種液為對照。將微孔板放入微生物生長測定儀中中速振蕩，每1 h測定其OD600 nm值，共5 d。

1.3.2.2 碳源利用特征

前處理方法同1.3.1.2中的BIOLOG鑒定，通過微生物對微孔板中的不同碳源利用及氧化情況進行測試，按照使用手冊對結(jié)果進行判讀。

1.3.3 發(fā)酵能力測定

1.3.3.1 魚塊制備及接種

魚塊處理：鮮大黃魚去內(nèi)臟，去皮后取背脊處魚肉，分割至規(guī)格一致，在超凈臺內(nèi)無菌水沖洗，晾干備用；菌懸液制備：菌株活化后分別在平板內(nèi)劃線，30 ℃培養(yǎng)24～48 h得到單菌落，挑取單菌落至100 mL無菌液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)18～24 h后，MRS中菌懸液濃度約109 CFU/mL，YPD液體培養(yǎng)基中約108 CFU/mL，經(jīng)多次離心、洗滌，重懸于無菌生理鹽水中，調(diào)整濃度約為107 CFU/mL，備用。

接種：取上述魚塊、菌懸液和紅酒糟，按魚塊的質(zhì)量進行菌懸液的接種和紅酒糟的添加。實驗共分4組，A組：添加紅酒糟，層糟層魚擺放；B組：添加短乳桿菌(2%)及紅酒糟；C組：添加釀酒酵母(2%)及紅酒糟；D組：添加短乳桿菌(1%)、釀酒酵母(1%)及紅酒糟。上述紅酒糟的添加量均為m(魚塊)∶m(紅酒糟)=1∶1，各組均采用無菌高溫蒸煮袋進行包裝，密封后20 ℃條件下發(fā)酵7 d，每24 h進行測定。

1.3.3.2 感官評定

參照賀林娟等[8]的方法，由具有感官評定經(jīng)驗及專業(yè)背景人員組成感官評定小組，在外觀、質(zhì)地和風(fēng)味3個方面對香糟大黃魚進行感官評定，其中風(fēng)味權(quán)重為40%，色澤和質(zhì)地均為30%，評定標準見表1。

表1 香糟大黃魚感官評定表
Table 1 Standards of sensory evaluation for vinasse large yellow croaker

1.3.3.3 菌株生長動力學(xué)及模型評價

每組稱取10 g魚肉樣品置于無菌生理鹽水中，研磨后進行梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度進行涂布，菌落總數(shù)、乳酸菌及酵母菌分別采用PCA、MRS和PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～3 d后計數(shù)。

模型構(gòu)建：采用修正的Gompertz方程擬合菌株生長動力學(xué)曲線，見公式(1)：

式中：Nt，t時間對應(yīng)的菌數(shù)，CFU/g；N0，初始菌數(shù)，CFU/g；Nmax，最大菌數(shù)，CFU/g；μmax，最大比生長速率，h-1；t，時間，d；Lag，延滯期，h。

模型評價：采用判定系數(shù)(R2)、均方誤差(root mean square error,RMSE)、偏差因子(Bf)和準確因子(Af)對模型擬合優(yōu)度進行評價，其中R2、Af和Bf值越接近于1，RMSE越接近于0，預(yù)測效果越好，評價方程如公式(2)(3)(4)所示。

式中：yobs，實測值；ycal，預(yù)測值；n，實測值個數(shù)。

1.3.3.4 色澤測定

取發(fā)酵大黃魚魚塊，使用色差計進行測定，記錄L*值、a*值、b*值。

1.3.3.5 理化指標的測定

pH、總酸(total acid，TA)、氨基態(tài)氮(amino acid nitrogen，ANN)、總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)測定分別按照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》、GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》(酸堿滴定法、以乳酸計)、甲醛滴定法、GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理及計算，使用Origin 8.0作圖，并按照修正Gompertz模型進行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢菌鑒定及其生理生化和碳源利用特征

經(jīng)分離、純化、BIOLOG鑒定和分子鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，紅酒糟中微生物由乳酸菌、酵母菌、芽胞桿菌等組成，如圖1所示。

圖1 紅酒糟中微生物菌相組成
Fig.1 Microbial phase composition in red vinasse

由圖2可知，J4-1與短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的相似度為100%, J3-1與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相似度99%， 且二者為紅酒糟中的優(yōu)勢菌， 占比分別為55.28%和41.74%。

a-細菌；b-酵母菌
圖2 優(yōu)勢菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.2 Phylogenetic tree of dominant strains

短乳桿菌和釀酒酵母生理生化和碳源利用特征見表2，短乳桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，釀酒酵母具有過氧化氫酶活性，可清除發(fā)酵過程中過氧化氫造成的酸敗。短乳桿菌具有脂肪酶活力，能通過酯的水解、合成、交換形成特殊風(fēng)味；但也有研究表明應(yīng)用于發(fā)酵肉制品中的乳酸菌無需脂肪酶和蛋白酶活性，否則會產(chǎn)生酸敗味[10]。

乳酸菌發(fā)酵過程中積累有機酸，降低pH，抑制病原微生物以減少危害[11]，一般要求在16～24 h內(nèi)使發(fā)酵體系pH降到5.3以下[12]，在本研究中37 ℃培養(yǎng)24 h及NaCl質(zhì)量分數(shù)為2%和4%條件下，pH均能下降到5.0以下。混合發(fā)酵中酵母菌通常與乳酸菌復(fù)配使用，因此酵母菌必須能夠具有低酸耐受性并有較高的活性使發(fā)酵繼續(xù)進行，釀酒酵母在pH 3～7時能生長，對酸性環(huán)境有一定的耐受性。在提倡低鹽健康生活的當下，通過接種乳酸菌發(fā)酵劑，并輔以低氧脅迫，控制有害微生物的生長，使發(fā)酵魚制品的安全性得到保障[13]；NaCl質(zhì)量分數(shù)2%～6%滿足在發(fā)酵制品中乳酸菌發(fā)酵劑對6%食鹽耐受性的要求；隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)升高至8%，酵母菌仍能夠生長。乳酸質(zhì)量分數(shù)1%～5%時，釀酒酵母均能生長，乳酸質(zhì)量分數(shù)升高至7%，生長受到抑制。已有研究表明乳酸菌和酵母菌之間存在信號分子，能促進或者抑制彼此生長[14]，本研究中的釀酒酵母與短乳桿菌在共培養(yǎng)中的相互作用還需進一步的研究。

碳源可供給微生物生命活動所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和能量。由表2可知，2株菌利用的碳源物質(zhì)種類差異較大，呈互補狀，短乳桿菌能利用α-D-葡萄糖，此糖為六碳糖，研究表明乳酸菌利用五碳糖、六碳糖代謝后可產(chǎn)生有機酸，除對滋味的貢獻外，還能與酵母菌產(chǎn)生的醇類相互作用生成酯類，增強風(fēng)味。釀酒酵母可利用多種類型碳源，具有較強的發(fā)酵能力，并且在生成物質(zhì)中，醇類和酯類能使發(fā)酵制品更加溫和濃郁。

表2 短乳桿菌和釀酒酵母生理生化和碳源利用特征
Table 2 Biochemical characterization and carbon source utilization of Lactobacillus brevis and S. cerevisiae

注：“+”表示呈陽性；“-”表示呈陰性；“/”表示該項無對應(yīng)內(nèi)容

2.2 發(fā)酵能力

2.2.1 感官評定

各組樣品感官綜合得分見圖3，在發(fā)酵前3 d，各組樣品間的感官評分無明顯差異，4 d后差異逐漸顯現(xiàn)，接種復(fù)合菌株的樣品組評分大于接種單一菌的發(fā)酵魚樣品。酵母菌和乳酸菌進行混合培養(yǎng)后，其產(chǎn)生的代謝物具有互補機制，能夠促進有機酸、游離氨基氮等含量的提高，從而利于增強風(fēng)味[14]。在實驗的過程中發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的加入促進紅酒糟中的刺激氣味逐漸變得柔和，提升了發(fā)酵大黃魚的風(fēng)味品質(zhì)。

2.2.2 微生物分析

乳酸菌和酵母菌生長動力模型評價參數(shù)見表3，該生長模型擬合優(yōu)度良好。

A-添加紅酒糟；B-添加紅酒糟及短乳桿菌； C-添加紅酒糟及釀酒酵母；D-添加紅酒糟、 短乳桿菌及釀酒酵母(下同)
圖3 大黃魚發(fā)酵過程中的感官綜合得分
Fig.3 Sensory comprehensive score of large yellow croaker during fermentation

表3 乳酸菌和酵母菌生長動力學(xué)模型評價
Table 3 Evaluation of lactic acid bacteria and yeast growth kinetic models

圖4為大黃魚發(fā)酵過程中微生物的變化，在發(fā)酵過程中，菌落總數(shù)整體處于較低狀態(tài)，D組樣品中菌落總數(shù)最低僅為2.70 lg CFU/g，推測由于紅酒糟具有較低的pH并含有抑菌物質(zhì)，進一步抑制了雜菌的生長。發(fā)酵魚中接種短乳桿菌和釀酒酵母后，其相應(yīng)生長曲線整體呈“S”型。

a-菌落總數(shù)；b-乳酸菌總數(shù)；c-酵母菌總數(shù)
圖4 大黃魚發(fā)酵過程中微生物的變化
Fig.4 Microbiological changes in large yellow croaker during fermentation

由表4所示乳酸菌生長動力學(xué)參數(shù)中可知，由于A和C樣品未接種短乳桿菌，乳酸菌均來自于紅酒糟，此時兩者μmax無明顯差別，B和D樣品由于接入短乳桿菌，故其μmax顯著大于A和C樣品的μmax，且B樣品的μmax顯著大于D，接入復(fù)合菌后乳酸菌延滯期變短。酵母菌生長動力學(xué)參數(shù)中A組和B組中未接入釀酒酵母，酵母菌均來自紅酒糟，此時兩者μmax無明顯差別；C和D中由于接入釀酒酵母，故其μmax大于A和B樣品，且接入復(fù)合菌后酵母菌延滯期變長。在前期研究中發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)條件下雖然低含量的乳酸能夠促進釀酒酵母的生長，但在魚塊中進行短乳桿菌和釀酒酵母的混合發(fā)酵，短乳桿菌和釀酒酵母的實際生長情況可能還受其他復(fù)雜因素的影響[15]。

2.2.3 色差分析

由于紅酒糟中含有紅曲霉菌產(chǎn)生的紅曲色素，故其在發(fā)酵過程中賦予了魚肉誘人及獨特的色澤。由圖5可知，在發(fā)酵過程中魚肉L*值逐漸下降，同樣在王乃富等[16]研究中鳙魚肉糜經(jīng)紅曲霉發(fā)酵后L*值明顯降低。添加紅酒糟及接種菌株后a*值、b*值顯著提升，魚肉表現(xiàn)出良好的色澤。樣品D在發(fā)酵結(jié)束時表現(xiàn)出最高的紅度值和黃度值，且添加釀酒酵母和短乳桿菌后的B、C和D樣品的a*值均大于A樣品，說明短乳桿菌和釀酒酵母的加入有助于發(fā)酵魚塊中紅色色澤的形成。在魚塊發(fā)酵過程中b*值波動較a*值大，B組和C組在發(fā)酵第2天時b*值達到最大，發(fā)酵后期逐漸降低后平穩(wěn)?？傮w上，添加紅酒糟組a*值總體在25左右波動，b*值在20左右波動，表明紅酒糟發(fā)酵大黃魚逐漸呈現(xiàn)了其區(qū)別于其他發(fā)酵產(chǎn)品的紅亮色色澤。綜上所述，在添加復(fù)合菌株和紅酒糟后的發(fā)酵大黃魚塊能夠形成良好的色澤，提升了發(fā)酵大黃魚的品質(zhì)。

表4 乳酸菌和酵母菌生長動力學(xué)參數(shù)
Table 4 Growth kinetic parameters of lactic acid bacteria and yeast

2.2.4 pH和TA含量變化

大黃魚發(fā)酵過程中pH和總酸含量的變化見圖6，由于紅酒糟本身具有較低的pH，發(fā)酵第1天，pH已下降至較低的狀態(tài)，在后續(xù)發(fā)酵中處于波動狀態(tài)。

a-L*；b-a*；c-b*
圖5 大黃魚發(fā)酵過程中色差的變化
Fig.5 The color changes of large yellow croaker during fermentation

a-pH；b-總酸
圖6 大黃魚發(fā)酵過程中pH和總酸含量的變化
Fig.6 Total acid changes of large yellow croaker during fermentation

發(fā)酵肉制品中前48 h的環(huán)境條件對有害病原體的生長和隨后的存活率至關(guān)重要，此外低pH值引起的蛋白聚集有利于提升發(fā)酵產(chǎn)品的穩(wěn)定性和緊實性，還可以抑制生物胺的形成，提高產(chǎn)品安全性。各樣品在發(fā)酵過程中總酸含量逐漸增高，在發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定；其中短乳桿菌實驗組在發(fā)酵前期，其總酸含量略高于其他實驗組，但在發(fā)酵后期接種復(fù)合菌實驗組總酸含量略高。

2.2.5 ANN含量變化

蛋白質(zhì)、多肽等含氮化合物在發(fā)酵過程中會逐漸降解成小分子肽、游離氨基酸等物質(zhì)[17]，可指示ANN含量的變化，見圖7。發(fā)酵前期ANN的含量均呈上升趨勢，而后未接種菌株和接種釀酒酵母實驗組氨基態(tài)氮含量逐漸下降，裘迪紅等[18]指出氨基態(tài)氮為蛋白質(zhì)的中間降解產(chǎn)物，可進一步代謝為小分子物質(zhì)，故呈先增加后降低的趨勢。短乳桿菌的接入可以明顯增加ANN的含量，其蛋白質(zhì)的降解是內(nèi)源蛋白酶和微生物酶共同作用的結(jié)果，而這2種因素對蛋白水解的貢獻還有待研究[19]。

圖7 大黃魚發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮含量的變化
Fig.7 Amino nitrogen changes in large yellow croaker during fermentation

2.2.6 TVB-N含量變化

TVB-N值與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨以及胺類等含氮物質(zhì)的含量呈正相關(guān)，與水產(chǎn)品品質(zhì)呈負相關(guān)[20]。由圖8所示，在各實驗組發(fā)酵魚中TVB-N在接種1 d后均已達到較高水平，可能是發(fā)酵過程中紅酒糟的液態(tài)基質(zhì)滲透到魚肉組織中，使得所檢測的魚肉中的TVB-N含量處于較高的狀態(tài)。隨著發(fā)酵時間的延長TVB-N含量下降，推測酒糟發(fā)酵所造成的酸性環(huán)境抑制了酶活性和蛋白質(zhì)分解；另外在BAO等[21]的研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵肉制品中乳酸菌可通過其產(chǎn)生的乳酸和細菌素來中和揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)，從而抑制TVB-N的積累。

圖8 大黃魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量的變化
Fig.8 Total volatile basic nitrogen changes in large yellow croaker during fermentation

3 結(jié)論

以源自香糟大黃魚中紅酒糟優(yōu)勢菌短乳桿菌和釀酒酵母為對象，分析了2種菌的生理生化、碳源代謝和發(fā)酵能力，表明短乳桿菌具有良好的酸化能力、低pH耐受性和高NaCl耐受性；釀酒酵母具有低pH、高NaCl及乳酸耐受性；2種菌碳源代謝類型差異較大。在接種實驗中，接種釀酒酵母能夠使紅酒糟中的刺激氣味逐漸變得柔和；紅酒糟可抑制雜菌的增殖，提供良好安全的環(huán)境，且發(fā)酵大黃魚逐漸呈現(xiàn)了區(qū)別于其他發(fā)酵產(chǎn)品的紅亮色澤。短乳桿菌的接入可加速發(fā)酵，增加氨基態(tài)氮的含量；短乳桿菌和釀酒酵母均可抑制大黃魚中腐敗菌的生長，降低發(fā)酵中產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，但對其抑制效應(yīng)和評價有待深入研究。