基于碳、氮同位素和礦物元素的青蘿卜產(chǎn)地判別

蘿卜一詞最早在中國古代專著《爾雅》被提及，稱其為“蘆菔”。青蘿卜是十字花科蘿卜屬一種常見的根莖類蔬菜，種植歷史悠久，可生食、做湯、干腌和鹽漬等，不僅富含人體所需的營養(yǎng)物質，而且具有一定藥用價值[1-3]。但是，由于不同地理來源的青蘿卜維生素C含量、外形、口感等存在差異，例如天津的沙窩蘿卜通常以水果蘿卜出名[4]，消化功能顯著，而山東濰坊的浮橋蘿卜鈣含量豐富。這類特色農(nóng)產(chǎn)品因其特殊的文化和自然因素、較高的口碑和經(jīng)濟價值，易遭遇摻假和假冒。因此，研究建立精準的青蘿卜產(chǎn)地溯源技術體系，對判別青蘿卜真實來源、維護消費者權益、規(guī)范市場秩序尤為重要。

目前在農(nóng)產(chǎn)品地理溯源方面常用到的產(chǎn)地判別技術包括礦物元素分析技術、穩(wěn)定同位素質譜技術、近紅外光譜技術及電子鼻技術等[5-7]。生物在生長的過程中受氣候、海拔和土壤性質等環(huán)境因素的影響，不同產(chǎn)地的農(nóng)產(chǎn)品體內穩(wěn)定同位素比值和礦物元素含量呈現(xiàn)出獨特性和差異性，具有明顯的地域特征[8-9]，因此，礦物元素分析技術、穩(wěn)定同位素質譜技術在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源中具備較高的應用價值，并且這兩項技術具有前處理操作簡單、判別模型精準度高等優(yōu)點，在眾多特色地標農(nóng)產(chǎn)品中被廣泛應用[10]。連思雨等[11]和BERTOLDI等[12]通過測定枸杞中的穩(wěn)定同位素、礦物元素等成分，結合主成分分析(principal components analysis，PCA)、偏最小二程判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)等化學計量方法建立判別模型，準確率高達95%以上；MA等[13]和王潔[14]基于礦物元素、礦物元素與穩(wěn)定同位素比率結合等方式對扁形茶、龍井茶的產(chǎn)地溯源技術進行探究，建立高精準度的鑒別模型，進一步肯定這2項技術在產(chǎn)地判別方面的作用；此外，礦物元素分析技術、穩(wěn)定同位素質譜技術等在谷物[15-17]、果蔬[18-19]以及藥材[20-21]、水產(chǎn)品[22-24]等眾多領域有著廣泛且高效的應用，但在蘿卜地理來源的鑒別方面鮮有應用研究。

本研究結合當前產(chǎn)地研究的現(xiàn)狀，選取山東、天津、河南3個省份具有地理標志認證的10個品種青蘿卜，通過測定穩(wěn)定同位素比值和礦物元素含量，開展青蘿卜地理信息的相關性研究與應用，并結合PLS-DA、線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)等化學計量學方法建立判別模型。旨在服務“三品一標”，為保護青蘿卜產(chǎn)品品種、品質、品牌以及提高經(jīng)濟效益提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集地理來源真實可靠的青蘿卜樣品177份，其中天津57份，河南59份、山東61份，具體信息如表1所示。穩(wěn)定同位素標準物質USGS43(δ13C=-21.34‰，δ15N=+8.44‰)，美國地質勘探局Reston穩(wěn)定同位素實驗室；元素國家標準物質菠菜GSBW10015，地球物理地球化學勘查研究所；元素標液為電感耦合等離子體分析用多元素標準溶液GNM-M311129-2013，國家有色金屬及電子材料分析測試中心逐級稀釋配得；濃硝酸(65%)，美國默克制藥。

表1 青蘿卜樣本基本信息
Table 1 The basical information of the green turnip samples

1.2 儀器與設備

Flash 2000元素分析儀、Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質譜儀，美國賽默飛世爾公司；NEXION 300X電感耦合等離子體質譜儀，美國珀金埃爾默股份有限公司；破壁機E310，美國Vitamix公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

青蘿卜樣品采集后，在實驗室用自來水將泥土清洗、陰干后，測定單個重量、長度等基礎數(shù)據(jù)。四分法分取蘿卜樣品并切塊，用破壁機將樣品勻漿粉碎，分取100 g勻漿后的樣品放入冷凍干燥機進行冷凍干燥(-50 ℃)12 h以上，干燥后樣品放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 穩(wěn)定同位素測定

碳、氮同位素比值的測定：取0.2 mg青蘿卜粉末樣品于錫杯(5 mm×8 mm)中壓實包好后直接放入元素分析儀自動進樣器中，在高溫下燃燒、還原，最終生成氣體，按N2、CO2的順序先后進入同位素比率質譜儀進行檢測。進樣序列中每隔10個樣品插入一個標物進行質量控制，樣品穩(wěn)定同位素比值應用標物進行單點校正。儀器標準偏差小于0.2‰。

儀器工作參數(shù)：氧化管溫度為1 150 ℃，還原管溫度為850 ℃，通氧時間為70 s，元素分析儀氦氣吹掃流量為230 mL/min，進入質譜儀氦載氣流量為100 mL/min，高純N2、CO2(純度>99.999%)為參考氣。

1.3.3 元素測定

用電子天平準確稱量0.3 g各產(chǎn)地青蘿卜凍干粉末樣品于消解罐中，每個樣品3個平行。向消解罐中加入10 mL濃硝酸，過夜，第2天不蓋蓋子在智能石墨消解爐中進行120 ℃石墨消解至澄清，約4 h，冷卻至室溫后從微波消解儀中取出，用少量去離子水分3次洗滌消解管，合并洗滌液及消解液，并定容至25 mL，進行上機檢測。

儀器工作參數(shù)：電感耦合等離子體質譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)每次測定前均進行自動調諧，根據(jù)儀器的狀態(tài)對參數(shù)進行調整，以滿足靈敏度、氧化物、穩(wěn)定性等各項指標。儀器調諧完畢后，將內標進樣管插入1 μg/mL 內標溶液中進行矯正，樣品管依次插入各濃度的標準溶液進行制作標曲，最后測定樣品。射頻功率1 230 W；載氣流速1.21 L/min；Babington霧化器，霧化室溫度2 ℃；蠕動泵轉速0.1 r/s。用內標法進行校正。儀器調諧完畢后，將內標進樣管插入1 μg/mL內標溶液中(分析過程中始終進內標溶液)，樣品管依次插入各濃度的標準溶液(濃度依次遞增)和待測樣中進行測定。

1.4 多元統(tǒng)計分析

應用Origin 8.0軟件對碳、氮穩(wěn)定同位素進行箱線圖分析，并應用SPSS 25.0進行單因素ANOVA檢驗，最后分別以所測青蘿卜中18種礦物元素為變量，應用SIMCA-P 13.0分析軟件進行PLS-DA建模，應用MPP軟件結合LDA算法建立青蘿卜產(chǎn)地判別模型。

2 結果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)青蘿卜多種礦質元素含量和穩(wěn)定同位素比值分析

本研究共測定天津、河南、山東3個省份177份青蘿卜樣品中的碳、氮同位素比值和18種礦物元素的含量。

首先通過箱線圖對不同地區(qū)的穩(wěn)定同位素值進行分析，如圖1所示。從整體分析，天津、河南、山東3個省份的青蘿卜樣品中的δ15N值為0.37‰～2.37‰，且均有重合，差異較小，天津和山東兩省樣本δ15N值范圍較廣，河南樣本的δ15N值范圍較為集中；山東、天津、河南3個省份的青蘿卜樣品δ13C值分布也顯示整體差異不顯著，范圍為-29.68‰～-27.88‰；從不同省份不同地區(qū)樣品細分發(fā)現(xiàn)，天津省的武清、西青兩個地區(qū)蘿卜的δ15N值存在差異，河南省固始縣與上蔡縣、固始縣與郟縣間的δ15N值存在差異，山東壽光和濰城、滕州兩個地區(qū)δ15N值存在差異；但不同地區(qū)樣品間δ13C值并未存在顯著差異。這表示碳、氮同位素在判別不同省份的青蘿卜時判別貢獻率較低，但δ15N值對進一步精確鑒別小產(chǎn)區(qū)青蘿卜的地理來源時可能會具有相對顯著貢獻，這與當?shù)氐耐寥罈l件、施肥狀況以及農(nóng)藥使用情況有關，可為今后進一步研究青蘿卜的產(chǎn)地提供依據(jù)。

A-不同省份δ13C值范圍；B-不同省份δ15N值范圍；C-不同亞地區(qū)δ13C值范圍；D-不同亞地區(qū)δ15N值范圍
圖1 不同地區(qū)青蘿卜樣品C、N同位素比值分析
Fig.1 Analysis of C and N isotope ratios of green turnip samples from different regions

其次，應用SPSS對所測定的18種礦物元素進行單因素ANOVA檢驗，由表2可知，天津、河南、山東3個省份的整體元素含量分為3個梯度，Na、Ca、P、Mg 4種元素含量較高，平均含量均超過1 000 mg/kg，且Na、Ca、Mg 3種元素在不同省份間均存在顯著差異，天津地區(qū)青蘿卜樣品中Na含量最高，達10 786 mg/kg，河南地區(qū)Ca含量最高為6 182.05 mg/kg，山東地區(qū)Mg含量最高為2 237.28 mg/kg；Fe、Sr、Zn、B、Ba、Mn、Cu相對較低，但整體元素含量均高于1 mg/kg，F(xiàn)e、Sr、Zn、B、Mn 5種元素在天津、河南、山東3個省份間均存在明顯差異；Mo、Cr、Ni、Se、Cd、As、Co 7種元素含量最低，平均含量小于1 mg/kg，其中只有As在不同省份間差異顯著(P<0.05)。

2.2 判別分析

植物中穩(wěn)定同位素比值和礦物元素含量的差異反映了其生長的環(huán)境及氣候條件，為進行產(chǎn)地溯源、建立模型提供了依據(jù)。由圖2分析結果可知，不同地區(qū)青蘿卜中的碳、氮同位素整體差異范圍小，因此，本研究在進行農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源時，采用礦物元素含量和

表2 不同地區(qū)青蘿卜元素含量分析 單位：mg/kg

Table 2 The analysis of element content in green turnip from different areas

注：不同小寫字母表差異顯著(P<0.05)

化學計量學方法結合的方式建立青蘿卜樣品的判別模型。目前，在產(chǎn)地溯源的研究中常用到的化學計量學方法主要包括PCA、PLS-DA、支持向量機(support Vector Machine，SVM)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(back propagation-artificial neural network，BP-ANN)以及LDA等。本文對青蘿卜樣品中的礦物元素含量進行分析，結合PCA-X、PLS-DA、LDA 3種算法建立產(chǎn)地判別模型。

圖2 三個產(chǎn)地青蘿卜VIP值
Fig.2 The results of VIP in green turnip from different producing areas

2.2.1 PLS-DA

PLS-DA是一種有監(jiān)督的識別方法，它既可以實現(xiàn)對數(shù)據(jù)進行降維，同時可以結合回歸模型利用一定的判別閾值對回歸結果進行判別分析，同時因其所建的模型比較穩(wěn)定，且具有很強的抗干擾能力，目前建立產(chǎn)地判別模型時被廣泛應用。對所有青蘿卜樣品按照省份進行分組，分為天津、河南和山東3個組別，提取青蘿卜樣品中5個主成分應用PLS-DA算法結合礦物元素含量進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，如圖2元素VIP貢獻值圖看出，Cr、Ca、Na、Mg、Ni、Cd共6種元素在青蘿卜判別時貢獻率較大。其中Ca、Na、Mg 3種元素與2.1中單因素ANOVA檢驗的判別結果一致。如圖3所示，由3個省份二維模型圖可以看出，天津樣品、河南樣品以及山東樣品3個省份的青蘿卜之間均有不同程度的重合，在判別時，天津僅有2個被誤判為山東樣品，山東樣品僅有1個被誤判為天津，不同省份樣品未發(fā)生明顯聚集。因此，基于青蘿卜礦物元素含量結合PLS-DA算法建立天津、山東、河南3個省份的青蘿卜樣品判別模型具有一定的實際應用意義。

圖3 蘿卜樣品PLS-DA歸類判別
Fig.3 Classification of green turnip from different producing areas by PLS-DA model

2.2.2 LDA

LDA是一種有監(jiān)督判別方法，以投影后類內方差最小，類間方差最大的原則對樣品數(shù)據(jù)進行降維，實現(xiàn)樣品的分類。應用LDA算法對3個省份的青蘿卜樣品中18種礦物元素進行統(tǒng)計分析，建立判別模型。結果如圖4所示，在進行模型驗證時，河南有4個樣品被誤判為山東樣品，在山東樣品判別時，分別有3個青蘿卜樣品被誤判為河南，2個青蘿卜樣品被誤判為天津，天津57個青蘿卜樣品52個均能被準確判別，僅有5個被誤判為山東樣品。河南樣品和天津樣品都容易誤判為山東，這與箱線圖的分析結果相符。由表3可知，應用PLS-DA對青蘿卜進行產(chǎn)地判別模型，天津蘿卜的預判效果較好，模型驗證和交叉訓練時模型的判別率為91.23%，但河南和山東樣品在模型中識別準確率較低；采用LDA算法建模，3個省份模型的驗證集和訓練集判別率均在90%以上，表明LDA算法在進行蘿卜產(chǎn)地溯源時的判別時的效果明顯高于PLS-DA，在模型訓練時整體判別率為93.79%，且Ca、Na、Mg元素在建模時依舊顯示較大貢獻率。

圖4 三個產(chǎn)地青蘿卜樣品LDA歸類判別
Fig.4 Classification of green turnip from different producing areas by LDA model

表3 LDA和PLS-DA模型預測準確率 單位：%

Table 3 The accuracy of LDA and SVM models

目前，王游游等[25]對絕明子產(chǎn)地溯源時發(fā)現(xiàn)，δ15N值、δ13C值等穩(wěn)定同位素和礦物元素結合對鑒別決明子產(chǎn)區(qū)有更加顯著的效果，篩選出具有顯著差異的19種礦物元素以及其中重要權重因子，肯定δ15N 值對農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地判別時的貢獻，并提出礦物元素對產(chǎn)地判別的效果明顯優(yōu)于同位素；楊健等[26]發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定同位素可單獨達到鑒別何首烏產(chǎn)地的效果，但穩(wěn)定同位素結合元素的模型判別率得到進一步提高；本文在分析青蘿卜樣品中的礦物元素含量以及同位素比值時，同樣發(fā)現(xiàn)礦物元素對產(chǎn)地判別的效果明顯優(yōu)于穩(wěn)定同位素，且單獨應用礦物元素對天津、山東、河南3個地區(qū)的青蘿卜樣品的判別率均在90%以上。因此，本文建立青蘿卜樣品的產(chǎn)地判別模型進一步肯定了礦物元素在青蘿卜產(chǎn)地鑒別中的實際應用意義，精簡進行青蘿卜溯源需要測定的變量，這為未來青蘿卜產(chǎn)地溯源提供理論依據(jù)，具有實際應用意義。

3 結論

本研究通過測定天津、河南、山東3個省份不同地區(qū)青蘿卜樣品中的穩(wěn)定同位素比值和礦物元素含量，首次為青蘿卜建立了產(chǎn)地鑒別模型。研究發(fā)現(xiàn)，這3個產(chǎn)地的樣品有明顯的地域分布特征，箱線圖分析、單因素ANOVA檢驗表明，元素在進行青蘿卜產(chǎn)地判別的貢獻明顯高于碳、氮穩(wěn)定同位素，18種礦物元素中，Na、Ca、Mg共3種元素在結合不同的化學計量學方法分析時均表現(xiàn)出顯著差異性。PLS-DA算法建立判別模型時，對山東和天津的樣品識別率較低，對天津樣品識別率較高，模型訓練整體判別率僅為86.44%；應用LDA算法進行產(chǎn)地鑒別時，模型對天津、河南、山東青蘿卜樣品的識別率均較高，模型在驗證和訓練的總體判別率分別為92.09%和93.79%。2種化學計量學方法進行判別分析的結果顯示，LDA對不同省份樣品的區(qū)分效果明顯優(yōu)于PLS-DA算法。本文首次對青蘿卜樣品的礦物元素和穩(wěn)定同位素進行分析，并結合化學計量學方法建立的產(chǎn)地判別模型，LDA算法在建模過程中表現(xiàn)良好。根據(jù)青蘿卜不同產(chǎn)地之間的差異性建模，礦物元素結合LDA算法的效果理想，可為下一步青蘿卜產(chǎn)地溯源技術的研究提供新的研究方向和理論依據(jù)。