基于牡蠣肽構(gòu)建油包水型乳液體系及其穩(wěn)定性研究

牡蠣肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，富含39.1%～53.1%(干基)的蛋白質(zhì)[1]，同時(shí)還含有維生素D，維生素B12，煙酸，核黃素，硫胺素等多種營養(yǎng)素[2]，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的海洋蛋白資源。目前，牡蠣主要以鮮食為主，精深加工產(chǎn)品少，發(fā)展空間大。牡蠣肽是以牡蠣肉為原料，經(jīng)酶解、精制而得的小分子低聚肽，大量研究表明，牡蠣肽具有抗癌活性[3]、抗皺紋恢復(fù)光老化[4]、抗氧化[5]等生物活性功能。

來源于海洋的牡蠣肽具有特殊的腥味，導(dǎo)致消費(fèi)者直接攝入口服的可接受程度較低；并且流動性較好的牡蠣肽基料具有極強(qiáng)的吸濕性，這限制了牡蠣肽相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與商品化利用。此外，肽類對胃腸道消化的高度敏感性嚴(yán)重影響其生物利用度[6]，生物活性肽的適用性會因其在口服過程中的低生物穩(wěn)定性而受到限制，導(dǎo)致其在達(dá)到人體預(yù)期目標(biāo)之前降解并喪失結(jié)構(gòu)和功能[7]。因此，構(gòu)建合適的遞送體系，保護(hù)牡蠣肽生物活性[8]，靶向運(yùn)輸遞送以提高牡蠣肽的生物利用度，同時(shí)掩蔽海洋源物質(zhì)特殊腥味，擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和意義。

乳液是通過將一種液體以細(xì)小液滴(通常約為0.1～10 μm)的形式分散到另一種不混溶的液體中而形成的熱力學(xué)不穩(wěn)定[9]體系。乳液系統(tǒng)是用于封裝，保護(hù)，輸送食品活性成分以及藥物的最優(yōu)選輸送系統(tǒng)[10]。近年來，穩(wěn)定的油包水(water/oil，W/O)乳劑的配方因其在封裝和保護(hù)敏感的水溶性生物活性營養(yǎng)素和藥物(例如維生素和礦物質(zhì))方面的潛在優(yōu)勢而受到了許多研究者的關(guān)注[11]。因此本研究選擇W/O乳液體系包封親水性的牡蠣肽，并探究乳液的理化性質(zhì)及對抗不同環(huán)境條件變化的穩(wěn)定性。研究結(jié)果可為改善牡蠣肽相關(guān)產(chǎn)品性能，擴(kuò)大牡蠣肽的應(yīng)用范圍，促進(jìn)牡蠣肽乳劑類相關(guān)功能保健產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

牡蠣肽，北京盛美諾生物技術(shù)有限公司；非轉(zhuǎn)基因一級大豆油(酸值為0.06 mg KOH/g，過氧化物值為0.026 g/kg)，中糧佳悅(天津)有限公司；食品級聚甘油蓖麻醇酸酯，上海源葉生物科技有限公司；超純水由實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

ULTRA-TURRAX-T18型高速剪切機(jī)，德國IKA公司；OLYMPUS-CX43型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯光學(xué)公司；JIDI-UP-Basic型超純水機(jī)，廣州吉迪儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；PEN3型電子鼻，德國AIRSENSE公司；NMI20-060H-I型核磁共振分析成像分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣肽基料的粉體學(xué)性質(zhì)表征

1.3.1.1 休止角

根據(jù)文獻(xiàn)[12]提供的方法并稍加改動，將玻璃漏斗垂直固定于鐵架臺上，使漏斗下端距離水平桌面的高度(H)為2.0 cm。將牡蠣肽粉末緩慢地倒入漏斗中，粉末自然下落直至堆積的粉末圓錐體頂端剛好接觸到漏斗下端停止，讀取粉末圓錐體直徑2R (cm)，并按公式(1)計(jì)算休止角：

休止角

(1)

1.3.1.2 滑動角

根據(jù)文獻(xiàn)[12]提供的方法并稍加改動，將長為L=50 cm的玻璃板水平放置，將其一端固定。準(zhǔn)確稱取6.00 g的牡蠣肽粉置于玻璃板的非固定端，緩慢抬升非固定端至粉體開始滑動，記錄此時(shí)玻璃板非固定端抬升高度(H)cm，并按式(2)計(jì)算滑動角：

滑動角

(2)

1.3.1.3 堆積密度與振實(shí)密度

堆積密度的測定[13]：取已稱重的10 mL量筒，質(zhì)量記為m，用漏斗將適量牡蠣肽粉勻速注入量筒中，精密稱定質(zhì)量，記為M，同時(shí)記錄粉末體積V1，堆積密度ρ1根據(jù)公式(3)計(jì)算：

(3)

振實(shí)密度的測定[14]：將上述裝有牡蠣肽粉的量筒從距離水平桌面大概2 cm處自由下落，重復(fù)25次，記錄粉末體積V2，根據(jù)公式(4)計(jì)算振實(shí)密度ρ2:

(4)

1.3.1.4 吸濕率

根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法，配制氯化鈉過飽和溶液(相對濕度75%)于干燥器中，室溫條件下飽和24 h。稱取3份牡蠣肽基料(1.456 7±0.582 6) g平鋪在稱量瓶中恒重48 h，然后轉(zhuǎn)移到過飽和氯化鈉溶液的干燥器中，12 d連續(xù)取樣稱重，根據(jù)公式(5)計(jì)算吸濕率:

吸濕率

(5)

1.3.2 W/O乳液的制備

采用超純水將牡蠣肽配制成質(zhì)量濃度為200 g/L的溶液作為水相，以含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))聚甘油蓖麻醇酸酯的大豆油為油相。將水相緩慢加入到油相中以12 000 r/min的速度剪切分散3 min制備得到W/O型乳液。

1.3.3 乳液相關(guān)指標(biāo)測定

1.3.3.1 乳化指數(shù)的測定

乳液的穩(wěn)定性可通過乳化層的高度隨時(shí)間的變化來定量[15]，通過乳化指數(shù)反應(yīng)乳液穩(wěn)定性，乳化指數(shù)計(jì)算如公式(6)所示：

乳化指數(shù)

(6)

式中：He為乳液乳化層的高度，mm；H為油水相混合液的總高度，mm。

1.3.3.2 乳液顯微鏡觀察

新鮮制備的乳液樣品取5 μL均勻涂于載玻片上，用蓋玻片輕緩覆蓋，以最大程度地減少乳液被破壞[16]。顯微鏡在100倍香柏油浸沒的明場模式條件下對乳液外觀形態(tài)進(jìn)行觀察并使用軟件CapStudio配套的相機(jī)定標(biāo)拍照，獲得液滴的形態(tài)照片[17]。

1.3.3.3 乳液液滴尺寸大小及分布

根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]提供的方法，選乳液的顯微形態(tài)照片，隨機(jī)選擇3個(gè)視野圖像，每個(gè)圖像用CapStudio Bioiogy 3.2.16軟件計(jì)數(shù)不少于100個(gè)液滴來分析乳液的平均粒徑和液滴粒徑分布。

1.3.4 電子鼻分析乳液掩蔽牡蠣肽氣味效果

取10 mL新鮮乳液樣品于50 mL頂空瓶中，立即加蓋密封，在室溫下靜置平衡30 min后測樣[19]。電子鼻進(jìn)樣針連接的活性炭過濾器經(jīng)烘干冷卻后進(jìn)行測樣，活性炭過濾的空氣作為載氣清洗傳感器陣列[20]，沖洗時(shí)間為120 s，進(jìn)樣流量為300 mL/min，載氣流速為300 mL/min；樣品測樣時(shí)間為60 s，取10個(gè)氣味傳感器響應(yīng)值穩(wěn)定后的數(shù)據(jù)做雷達(dá)圖分析乳液對牡蠣肽氣味包封效果。

1.3.5 乳液黏度

取新鮮乳液2 mL，采用35 mm不銹鋼平行板及配套的P35探頭，間隙為1 mm，在25 ℃條件下，剪切速率范圍為10～500 1/s，選擇連續(xù)剪切模式測定新鮮乳液的表觀黏度。

1.3.6 低場核磁成像

用標(biāo)準(zhǔn)樣品放入磁體箱內(nèi)進(jìn)行參數(shù)校正設(shè)置，然后將盛有2 mL乳液樣品的塑料皿置于成像線圈樣品臺中心，成像軟件選用NiuSE序列自旋回波成像。

1.3.7 乳液穩(wěn)定性分析

1.3.7.1 不同貯藏溫度條件下乳液穩(wěn)定性分析

選取最佳工藝參數(shù)制備新鮮乳液，將制備的乳液轉(zhuǎn)移到透明玻璃瓶中，分別在4、25、35 ℃條件下靜置貯藏15 d，每天測定乳液的乳化指數(shù)，拍照記錄宏觀相行為，觀察乳液液滴顯微形態(tài)并測量粒徑，分析貯藏環(huán)境溫度對乳液的影響。

1.3.7.2 乳液離心穩(wěn)定性

新鮮乳液在室溫條件下4 000 r/min離心30 min以及8 000 r/min離心30 min，根據(jù)離心保留率評價(jià)乳液樣品的離心穩(wěn)定性。離心保留率根據(jù)公式(7)計(jì)算：

離心保留率

(7)

1.3.7.3 乳液熱穩(wěn)定性

制備新鮮乳后，立即對乳液進(jìn)行水浴加熱處理[21]，選擇的加熱條件包括高溫短時(shí)處理(90 ℃、3 min)、低溫長時(shí)處理(70 ℃、30 min)和極端熱處理工藝(90 ℃、45 min)，然后立即用流動的自來水快速冷卻加熱的乳液[22]，觀察乳液表觀相行為測定乳化指數(shù)。

1.3.7.4 乳液循環(huán)凍融穩(wěn)定性

將制備的新鮮乳液轉(zhuǎn)移到50 mL帶蓋樣品瓶中，在-18 ℃冷凍貯存24 h后，在室溫條件解凍1 h，觀察乳液表觀相行為變化，循環(huán)凍融操作3次[23]，觀察乳液表觀相行為測定乳化指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Orgin 9.1做圖。使用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析，采用Duncan法測定各變量平均值之間的顯著性差異，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣肽基料性質(zhì)測定結(jié)果

牡蠣肽基料體外觀及顯微觀察如圖1-a所示，外觀均勻無雜質(zhì)呈黃褐色粉末狀。休止角也稱安息角或自然坡度角，是粉體自然堆積斜面與底部水平面所夾銳角[24]；休止角表示物料顆粒之間的集聚或團(tuán)聚能力；滑動角表示物料顆粒在接觸面上的附著能力[12]。其大小直接反映粉體的流動性，休止角越小流動性越好[24]。對于食品粉體，通常認(rèn)為休止角小于30 °時(shí)流動性好[12]。牡蠣肽粉的休止角為(22.29±0.49)°，滑動角為(29.19±0.46)°，表明牡蠣肽粉具有極佳的流動性。堆積密度與粉體粒徑大小、微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)，堆積密度越小，表示粉體越疏松[25]，牡蠣肽基料的堆積密度為(0.469 7±0.007 6) g/mL，振實(shí)密度為(0.585 7±0.006 9) g/mL，表明牡蠣肽基較疏松，這有利用與其他原料混合復(fù)配。雖然牡蠣肽具有較好的流動性，但是其吸濕能力也較強(qiáng)(圖1-b)，嚴(yán)重限制了其在食品商業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

a-牡蠣肽基料的直觀圖及顯微觀察圖； b-牡蠣肽粉吸濕率變化曲線
圖1 牡蠣肽粉顯微觀察圖和吸濕曲線
Fig.1 Microscopic observation and moisture absorption curve of oyster peptide powder

對牡蠣肽粉的吸濕率曲線進(jìn)行二項(xiàng)式回歸擬合，得吸濕方程為：y=-0.002 2d2+0.044 3d+0.155 9，其中R2為0.947 2，表明擬合性較好。對吸濕方程一階求導(dǎo)，得吸濕速率方程為v=-0.004 4d+0.044 3，當(dāng)吸濕速率為0時(shí)，說明牡蠣肽粉吸濕達(dá)平衡狀態(tài)，計(jì)算可知平衡時(shí)吸濕率為37.89%，這與12 d連續(xù)測定結(jié)果接近。與其他肽類的吸濕性結(jié)果相比，牡蠣肽平衡時(shí)吸濕率均高于文獻(xiàn)中[26]的不同動物來源(豬皮、牛皮、驢皮、鱈魚皮、牛骨)膠原肽的吸濕性，這樣的結(jié)果推測與肽的來源、種類及肽段氨基酸序列中不同的親水基團(tuán)有關(guān)。

2.2 W/O乳液部分理化性質(zhì)表征分析

2.2.1 乳液黏度及核磁成像結(jié)果

由圖2-a可知，乳液黏度隨剪切速率的增加而逐漸降低，到一定剪切速率后黏度趨于平緩，表明乳液在外力剪切時(shí)，分子結(jié)構(gòu)被破壞，分子間結(jié)合力變差，黏度降低[27]，呈現(xiàn)剪切稀化現(xiàn)象，表明該乳液是假塑性流體。

在偽彩色圖像中，水分含量較高的區(qū)域顯示為紅色，否則顯示為藍(lán)色[28]。如圖2-b所示，圖像顯示均勻的藍(lán)色，說明油相作為連續(xù)相較好地覆蓋了分散水相，同時(shí)藍(lán)色在形成的圖像上均勻分布表明乳液分布，證實(shí)了油相對含有牡蠣肽水相的良好包裹。YANG等[29]通過低場核磁(low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)成像測量了雙乳狀液的質(zhì)子密度，通過這種簡單且無損的方法進(jìn)一步解釋乳液中水分布與穩(wěn)定性之間的關(guān)系?；诘蛨龊舜殴舱癯上?magnetic resonance imaging，MRI)的快速無損表征方法，被認(rèn)為是最有吸引力的非侵入性技術(shù)之一，適用于追蹤食品原料中的物理化學(xué)變化[28]，也是不透明樣品(乳液)分析的理想選擇，提供了有利的方法表征樣品相關(guān)特性[30]。

a-乳液剪切黏度變化特性曲線；b-乳液核磁成像圖
圖2 乳液流變及核磁成像結(jié)果圖
Fig.2 Emulsion rheological and NMR imaging results

2.2.2 乳液掩蔽牡蠣肽腥味效果

PEN3型電子鼻傳感器陣列及其主要特性見表1。

表1 電子鼻傳感器性能描述
Table 1 Performance description of electronic nose sensor

海洋產(chǎn)品的牡蠣肽具有不愉悅腥味，嚴(yán)重限制了消費(fèi)者對牡蠣肽等一系列海洋產(chǎn)品的接受程度。電子鼻感官分析的結(jié)果可以提高感官評價(jià)的判別效率和準(zhǔn)確性，是一種方便有效的氣味評價(jià)感官方法[31]。表1和圖3結(jié)果表明，W1W表示的無機(jī)硫化物是牡蠣肽腥味物質(zhì)的主要來源[32]，乳液與牡蠣肽溶液的電子鼻分析結(jié)果對比顯示，乳液對牡蠣肽的不愉快腥味具有明顯的掩蔽效果。因此，通過乳化技術(shù)制備乳液體系掩蔽不良腥味來實(shí)現(xiàn)改善牡蠣肽相關(guān)產(chǎn)品的利用性能具有可行性。

圖3 乳液對牡蠣肽腥味掩蔽效果雷達(dá)圖
Fig.3 Effect of emulsion masking oyster peptide fishy smell

2.3 不同貯藏溫度條件下乳液的穩(wěn)定性

為模擬乳液產(chǎn)品在不同季節(jié)環(huán)境中的貯存情況，將最佳條件下制備的乳液置于不同溫度環(huán)境中恒溫貯藏，直觀效果如圖4所示。新鮮乳液平均粒徑為(0.64±0.05) μm，4 ℃貯藏15 d后平均粒徑為(0.71±0.06) μm，25 ℃貯藏15 d后平均粒徑為(0.82±0.11) μm，35 ℃貯藏15 d后平均粒徑為(0.88±0.13) μm，在35 ℃貯藏15 d后平均粒徑顯著高于25 ℃和4 ℃組。圖5結(jié)果表明，在35 ℃環(huán)境中貯藏的乳液會出現(xiàn)絮凝結(jié)塊現(xiàn)象，不利于乳液的貯藏。這與茅娟芝等[33]的高溫條件不利于乳液穩(wěn)定結(jié)果一致。

a-乳液在不同溫度貯藏15 d的直觀效果圖； b-新鮮乳液在不同溫度環(huán)境貯藏15 d前后的顯微圖
圖4 乳液在不同溫度條件下貯藏15 d直觀效果和顯微結(jié)構(gòu)圖
Fig.4 Visual effect and microstructure diagram of emulsion stored for 15 days under different temperature

圖5 乳液在不同溫度條件貯藏粒徑分布及變化
Fig.5 Size distribution and variation of emulsion storage at different temperatures conditions

圖4和圖5表明，較高的貯藏溫度條件下導(dǎo)致液滴與液滴之間的碰撞頻率增加，這會導(dǎo)致液滴之間在沒有強(qiáng)烈排斥力的條件下促進(jìn)聚集[34]，也是35 ℃條件出現(xiàn)大液滴，平均液滴粒徑較大的原因。乳液在4 ℃環(huán)境下貯藏時(shí)不結(jié)晶，仍具有較好的流動性。與同類型乳液產(chǎn)品比較，朱加進(jìn)等[35]制備的W/O乳液常溫條件下保藏穩(wěn)定，也不適合高溫貯藏。因此，乳液在4 ℃低溫和室溫25 ℃條件下均有較好的貯藏穩(wěn)定性。

2.4 乳液離心穩(wěn)定性結(jié)果

乳液在4 000 r/min離心30 min時(shí)無相分離現(xiàn)象，乳化指數(shù)和離心保留率均為100%。此時(shí)乳液無任何相分離現(xiàn)象，圖6所示。因?yàn)檫B續(xù)油相的高黏度阻礙液滴相對運(yùn)動，使得乳液液滴相互碰撞接觸的程度減少，也證明油相對分散相的良好包裹效果，因此表現(xiàn)出極佳的穩(wěn)定性。進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)速在8 000 r/min 離心30 min時(shí)，隨著離心力強(qiáng)度的增加，僅有少量油相上浮，無水相析出，乳化指數(shù)為(92.11±0.19)%，離心保留率為(91.66±0.62)%。朱加進(jìn)等[35]制備的南極磷蝦油W/O型微乳液在3 000 r/min離心30 min后依然不分層，說明微乳的穩(wěn)定性良好。試驗(yàn)結(jié)果與同類型乳液相比，經(jīng)歷高轉(zhuǎn)速二次離心時(shí)仍然具有一定的穩(wěn)定性。因此，乳液對抗離心作用時(shí)具有極好的穩(wěn)定性。

圖6 乳液在不同離心條件下的直觀效果圖
Fig.6 Visual effect diagram of emulsion under different centrifugal conditions

2.5 乳液熱穩(wěn)定性結(jié)果

加熱是食品常見加工方法，主要用于確保食品的微生物安全，加熱條件是模擬制造商對相似類型產(chǎn)品應(yīng)用的處理?xiàng)l件進(jìn)行[36]。加熱會引起吸附到液滴表面乳化劑分子的構(gòu)象變化，從而改變其穩(wěn)定液滴抵抗聚集的能力[34]，同時(shí)加劇了液滴運(yùn)動碰撞進(jìn)一步導(dǎo)致不穩(wěn)定。圖7結(jié)果表明，在70 ℃加熱30 min和90 ℃加熱3 min條件下不會對樣品的穩(wěn)定性產(chǎn)生明顯影響，說明該乳液體系對抗常規(guī)熱巴氏滅菌處理具有良好的穩(wěn)定性。在極端熱處理90 ℃加熱45 min后有少部分水相析出，乳液分層，其乳化指數(shù)為(82.6±1.3)%，表明乳液對抗加熱應(yīng)力具有穩(wěn)定性。

a-乳化指數(shù)；b-直觀效果
圖7 乳液不同熱處理的乳化指數(shù)及直觀效果
Fig.7 Emulsification index and visual effects of different heat treatments of emulsion

2.6 乳液反復(fù)凍融結(jié)果

冷凍是保持食品營養(yǎng)和感官特性、抑制化學(xué)和微生物引起的腐敗以及延長食品貨架期的有效方式[37]。乳狀液在冷凍、貯藏及解凍過程中，穩(wěn)定性受多種因素的影響，極易出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象，造成食品感官、營養(yǎng)價(jià)值下降或縮短食品貨架期等[37]。如圖8所示，乳液經(jīng)3次反復(fù)凍融后，仍具極好的穩(wěn)定性，無任何相分離現(xiàn)象，乳化指數(shù)均為100%，說明該乳液對抗反復(fù)凍融體現(xiàn)出極好的穩(wěn)定性。鐘明明等[23]制備的乳液產(chǎn)品經(jīng)過1次凍融循環(huán)部分乳液能保持相對較好的穩(wěn)定性，而經(jīng)過2次凍融循環(huán)后乳液會出現(xiàn)不同程度的分層現(xiàn)象，這可能與制備乳液的類型及使用的乳化劑有關(guān)。

圖8 乳液經(jīng)過3次凍融的直觀效果
Fig.8 The visual effect of the emulsion after three freeze-thaw cycles

3 結(jié)論與討論

具有多種活性功能的牡蠣肽基料具有較好的流動性，但是極強(qiáng)的吸濕能力限制了其在食品工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用，同時(shí)由于特殊的海洋來源方式使其具有不愉悅的腥味，嚴(yán)重限制了消費(fèi)者對牡蠣肽相關(guān)產(chǎn)品的接受程度。剪切乳化技術(shù)制備的牡蠣肽W/O型乳液，可以明顯掩蔽不愉快腥味，為相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了除腥新思路。同時(shí)乳液在對抗不同環(huán)境應(yīng)力時(shí)均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，表明其在乳劑相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用具有一定潛力。綜上，試驗(yàn)結(jié)果將為牡蠣肽在乳劑類功能保健食品行業(yè)中的更廣泛應(yīng)用提供可能性，為牡蠣肽的穩(wěn)態(tài)化遞送體系開發(fā)設(shè)計(jì)提供參考。