纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油的品質(zhì)及其活性評價

肉豆蔻(Myristica fragrans)別名肉蔻、玉果等，為肉豆蔻科常綠高大喬木，目前在廣東、云南等地大量種植[1]。其種子呈卵珠形，在冬、夏兩季果實(shí)成熟時采收，種子中含有多種活性成分，尤其揮發(fā)油含量較高。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，肉豆蔻揮發(fā)油是肉豆蔻中重要的功能成分，具有抑菌、抗癌、保肝等多種功能作用[2-3]。

目前，已報(bào)道的有關(guān)肉豆蔻揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾提取、超臨界CO2萃取工藝、亞臨界萃取工藝、微波輔助水蒸氣蒸餾提取和超聲輔助提取工藝法等[4-5]。在這些提取方法中，均存在不同程度的缺陷，如水蒸氣蒸餾法提取時間較長；超臨界CO2萃取和亞臨界萃取所需儀器設(shè)備昂貴；微波輔助提取時溫度較高，容易對揮發(fā)油產(chǎn)生過熱反應(yīng)；超聲輔助提取時熱效應(yīng)較差，不能達(dá)到提取所需要的溫度。因此，探尋操作方便，成本低廉的揮發(fā)油提取方法依然是研究熱點(diǎn)。而采用酶法輔助水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油的工藝還未見報(bào)道，尤其酶法輔助水蒸氣蒸餾提取對揮發(fā)油的品質(zhì)是否產(chǎn)生影響值得深入研究。此外，國內(nèi)外許多學(xué)者做了大量有關(guān)植物揮發(fā)油抗氧化活性的研究，而關(guān)于肉豆蔻揮發(fā)油清除亞硝酸鹽作用和阻斷亞硝胺合成的作用還未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，采用纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾和傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油，通過對揮發(fā)油提取率、感官特征、理化性質(zhì)、化學(xué)成分、主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)性質(zhì)和肉豆蔻原料的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，再研究揮發(fā)油消除亞硝酸鹽的作用和阻斷亞硝胺合成的作用，為擴(kuò)大肉豆蔻揮發(fā)油的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)高效利用肉豆蔻揮發(fā)油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉豆蔻購自安徽毫州福生堂中藥材公司，經(jīng)粉碎過20目篩后于4 ℃冰箱保存；冰乙酸、三氯甲烷、硫代硫酸鈉、NaNO2，成都市科隆化學(xué)品有限公司；碘化鉀，廣東光華科技股份有限公司；N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，上海阿拉丁生化科技有限公司；對氨基苯磺酸，成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為常規(guī)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XH-JSG揮發(fā)油測定器，上海臻潯金屬制品有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；NicoletIS10傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Q200MDSC差示掃描量熱儀，美國TA儀器有限公司；Evo18掃描電子顯微鏡，德國卡爾·蔡司股份公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肉豆蔻揮發(fā)油的提取

1.3.1.1 水蒸氣蒸餾提取

按照《中國藥典》I部(2010年)附錄XD中甲法進(jìn)行提取。稱取20 g肉豆蔻粉末置于500 mL圓底燒瓶，按一定料液比加水，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，將燒瓶置電熱套中加熱至沸騰，并保持沸騰300 min，至測定器中油量不再增加。揮發(fā)油提取率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：c為提取率，%；m1為揮發(fā)油體積，mL；ρ為揮發(fā)油密度，g/mL；m2為肉豆蔻粉末質(zhì)量，g。

1.3.1.2 酶法輔助水蒸氣蒸餾提取

稱取20 g肉豆蔻粉末于具塞燒瓶中，加入一定體積的水，調(diào)節(jié)溫度和pH，再按照肉豆蔻粉末質(zhì)量加入一定量纖維素酶，蓋塞，在水浴恒溫振蕩器中進(jìn)行酶解；酶解完成后，連接揮發(fā)油測定器和冷凝管，采用電熱套加熱至微沸，進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取。揮發(fā)油提取率按公式(1)計(jì)算。單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定的纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：酶添加量1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，pH 4.0，酶解溫度45 ℃，液料比13∶1(mL∶g)，酶解時間47 min，蒸餾時間193 min，進(jìn)行蒸餾提取。

1.3.2 肉豆蔻粉末的掃描電鏡觀察

將未提取處理、水蒸氣蒸餾提取和纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取后的肉豆蔻粉末經(jīng)真空干燥后，作噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.3 肉豆蔻揮發(fā)油感官品質(zhì)及其基本理化指標(biāo)測定

1.3.3.1 感官品質(zhì)評價

將2種方法提取的揮發(fā)油按照GB/T 14454.2—2008 《香料 香氣評定法》第2法成對比較檢驗(yàn)法測定。

1.3.3.2 理化指標(biāo)測定

將2種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油按GB/T 11540—2008 《香料 相對密度的測定》、GB/T 14454.6—2008《香料 蒸發(fā)后殘留物含量的評估》、GB/T 14455.5—2008 《香料 酸值或含酸量的測定》、GB/T 14455.6—2008 《香料 酯值或含酯量的測定》和GB/T 33918—2017 《香料 過氧化值的測定》分別測定相對密度、蒸發(fā)后殘留物含量、酸值、酯值和過氧化值；按GB/T 14455.5測得的酸值加上按GB/T 14455.6測得的酯值計(jì)算皂化值。

1.3.4 GC-MS測定

參考李力等[6]方法稍作修改，分析條件如下：GC條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(柱長30 m，膜厚0.25 μm，內(nèi)徑0.25 mm)；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比20∶1；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 速率升至230 ℃，保持10 min。MS條件：電子轟擊(electron impact，EI)離子源，電子能量70 eV，GC與MS接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電子檢測器檢測電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍50～550 amu。

1.3.5 紅外光譜測定

采用溴化鉀片涂布法：取2 μL肉豆蔻揮發(fā)油均勻涂布在KBr窗片上，放入樣品槽。掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)32次，用KBr鹽窗作背景采集。

1.3.6 差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)測定

將肉豆蔻揮發(fā)油樣品10 μL裝入微型液體鋁坩堝中，加上坩堝蓋，將其密封后放入樣品室內(nèi)，用空坩堝作空白對照，DSC分析在高純氮?dú)鈿夥毡Ｗo(hù)下進(jìn)行。溫度在-50～300 ℃，升溫速率為10 ℃/min，流速為50 mL/min，記錄其吸熱和放熱曲線。

1.3.7 肉豆蔻揮發(fā)油對亞硝酸鹽清除率的測定

參考廖曉峰等[7]的方法：將0.5 mol/L的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH 3.0)5 mL置于10 mL容量瓶中，加入100 mg/L的NaNO2溶液1 mL，分別加入提取液(0、100、200、300、400、500、600、700、800 μg，下同)，定容至刻度，37 ℃下反應(yīng)1 h。取1 mL反應(yīng)液于50 mL容量瓶，加入0.4%對氨基苯磺酸溶液2 mL，0.2%鹽酸萘乙胺溶液1 mL，搖勻放置15 min后，于540 nm處測吸光度值Ax，同時測定保溫反應(yīng)時不加揮發(fā)油的空白試驗(yàn)的吸光值A0。所有樣品平行測定3次，取平均值。測定結(jié)果以清除率(E)表示，清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.3.8 肉豆蔻揮發(fā)油對亞硝胺阻斷率的測定

參考廖曉峰等[7]的方法，分別取不同用量肉豆蔻揮發(fā)油于25 mL比色管中，加入pH 3.0檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液10 mL，1 mmol/L NaNO2溶液和二甲胺溶液各1.0 mL，稀釋至刻度并于37 ℃恒溫水浴1 h。然后吸取1.0 mL上述反應(yīng)液至50 mL燒杯，加入0.5%Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析儀上照15 min；取出后加入1%對氨基苯磺酸1.5 mL、0.1% α-萘胺1.5 mL和蒸餾水0.5 mL，靜置15 min，525 nm 下測吸光度A1，同時測定以去離子水代替NaNO2標(biāo)液的空白試驗(yàn)吸光度A2，及以去離子水代VOMF的空白試驗(yàn)吸光度A0。所有樣品平行測定3次，取平均值。測定結(jié)果以阻斷率(B)表示，阻斷率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法肉豆蔻揮發(fā)油提取率的比較

由表1可知，水蒸氣蒸餾耗時300 min的提取率為9.15%，纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾耗時240 min的提取率為10.69%，比水蒸氣蒸餾法提高了16.83%，說明此方法不僅能明顯縮短水蒸氣蒸餾的時間、節(jié)約能耗，還顯著提高了肉豆蔻揮發(fā)油的提取率。

表1 兩種方法提取率的比較
Table 1 Comparison of extraction rate of two methods

2.2 兩種提取方法對肉豆蔻原料微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，提取前后肉豆蔻原料微觀結(jié)構(gòu)存在明顯差異，未提取處理樣品(圖1-a)的整體外部形狀相對完整，結(jié)構(gòu)緊密沒有明顯破壞；水蒸氣蒸餾提取后(圖1-b)肉豆蔻的表面結(jié)構(gòu)被明顯破壞，出現(xiàn)部分孔洞。相比水蒸氣蒸餾，纖維素酶處理后(圖1-c)肉豆蔻的表面結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，變得雜亂無序和松散，出現(xiàn)更多孔洞、碎塊和不規(guī)則的腔。CHANDRAN等[8]在研究酶預(yù)處理對從香料(即黑胡椒和豆蔻)中提取活性化合物的影響時，通過微觀結(jié)構(gòu)觀察證實(shí)了酶的作用能破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。BABY等[9]在研究酶前處理對茴香揮發(fā)油提取率的影響時觀察了酶對茴香種子細(xì)胞壁的影響，也發(fā)現(xiàn)了經(jīng)酶處理過的茴香種子微觀結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生破裂。尤其纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取的耗時明顯短于水蒸氣蒸餾提取，但是其原料微觀結(jié)構(gòu)的破裂程度卻比水蒸氣蒸餾更加嚴(yán)重。因此，肉豆蔻揮發(fā)油提取率增加和提取時間縮短的主要原因是纖維素酶對原料細(xì)胞壁進(jìn)行了降解，使被束縛在細(xì)胞內(nèi)的有效成分充分溶出，從而使得揮發(fā)油得到快速提取。

a-未經(jīng)處理組；b-水蒸氣蒸餾處理組；c-酶法輔助水蒸氣蒸餾處理組
圖1 未經(jīng)處理、水蒸氣蒸餾處理、酶法輔助水蒸氣蒸餾 處理提取后的肉豆蔻原料的電鏡掃描觀察
Fig.1 Scanning electron microscope observation of nutmeg powder extracted by untreated, steam distillation and enzyme assisted steam distillation

2.3 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的感官品質(zhì)及其基本理化指標(biāo)比較

由表2可知，2種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油都具有較好的感官品質(zhì)，為無色透明、擁有純正肉豆蔻香味的油狀液體。其他的理化指標(biāo)也非常相近，表明纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取對肉豆蔻揮發(fā)油的理化性質(zhì)沒有任何決定性影響。GIBBINS等[10]在做響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助水提取紅花油時也有同樣的結(jié)論。肉豆蔻揮發(fā)油比水輕，2種方法提取的揮發(fā)油相對密度均在0.850～1.065 g/mL正常區(qū)間內(nèi)。蒸發(fā)后殘留物含量均在1.30%左右，說明肉豆蔻揮發(fā)油的揮發(fā)性較好，且提取的揮發(fā)油純度較高。酸值和過氧化值均較低，說明肉豆蔻揮發(fā)油的抗氧化性好，品質(zhì)純正[11]。

表2 兩種方法提取的揮發(fā)油感官品質(zhì)和基本理化指標(biāo)比較
Table 2 Comparison of sensory quality and basic physical and chemical indexes of volatile oil extracted by two methods

2.4 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分比較

利用NIST11質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索標(biāo)準(zhǔn)譜庫解析成分，以相似度>85%作為結(jié)果確認(rèn)依據(jù)，小于該值即定義為未知，以峰面積歸一法計(jì)算各組分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。成分解析結(jié)果見表3。

由表3可知，兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油中組成成分種類和含量基本相同。水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油總共鑒定出占揮發(fā)油含量94.85%的38種化合物，纖維素酶輔助提取的揮發(fā)油共鑒定出占揮發(fā)油含量94.31%的42種化合物。2種方法提取得肉豆蔻揮發(fā)油的主要成分均是萜烯類、醇類、醚類、酯類、酚類化合物，其中β-松油烯和肉豆蔻醚含量最高。王瑩等[12]在分析商品肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分時得出肉豆蔻醚和萜類化合物是其主要成分的結(jié)論，DUPUY等[13]在分析肉豆蔻精油成分也得出了類似結(jié)論，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相符。GC-MS結(jié)果表明，纖維素酶處理后對肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分和含量并沒有顯著影響，可以為酶法輔助水蒸氣蒸餾提取提供參考。

表3 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的化學(xué)成分分析
Table 3 Chemical composition analysis of volatile oil from nutmeg extracted by two methods

2.5 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的紅外光譜比較

由圖2可知，兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油均有較多吸收峰，且峰形和峰位基本吻合。二者均在1 700～800 cm-1有多個明顯的吸收峰，依據(jù)劉艷等[14]和DONG等[15]文獻(xiàn)報(bào)道，其中1 633、1 652 cm-1附近是CC伸縮振動引起的，1 510、1 464、1 451 cm-1附近為芳香族CC伸縮振動吸收峰；在3 500～2 500 cm-1的官能團(tuán)區(qū)二者均有幾個明顯的特征蜂，其中3 076 cm-1附近為烯烴的C—H伸縮振動，2 958、2 931 cm-1附近為C—H反對稱伸縮振動吸收峰，2 871 cm-1附近為C—H對稱伸縮振動吸收峰。由此可知，纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾提取對肉豆蔻揮發(fā)油主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響。

a-水蒸氣蒸餾法；b-纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾法
圖2 兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油紅外光譜圖
Fig.2 Infrared spectrum of volatile oil extracted from nutmeg by two methods

2.6 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的熱力學(xué)性質(zhì)比較

DSC是一種消耗更少的時間和樣本，可以快速表征物質(zhì)熱力學(xué)特性的熱分析方法[16]。由圖3可知，在升溫過程中，兩種方法提取的油樣均只出現(xiàn)了1個吸熱峰，峰值溫度均在210 ℃左右，油樣在高溫作用下吸熱汽化，形成了明顯的吸熱峰。在降溫過程中，2個油樣均無放熱峰，原因是肉豆蔻揮發(fā)油已經(jīng)揮發(fā)完全，無法形成放熱峰。由于兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油的吸熱和放熱曲線整體形狀、峰型均相似，表明纖維素酶處理對肉豆蔻揮發(fā)油的熱力學(xué)性質(zhì)沒有影響。

2.7 肉豆蔻揮發(fā)油對亞硝酸鹽清除作用的影響

由圖4可知，兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油均對NaNO2有明顯清除作用，且隨著濃度增大清除率逐漸增大，在一定濃度范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。整體上來看，酶法輔助提取揮發(fā)油對NaNO2的清除能力略大于水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油對NaNO2的清除能力，差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)肉豆蔻揮發(fā)油用量為800 μg時，兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油的清除率分別達(dá)到69.34%和73.89%。鄭立輝等[17]在研究白芷精油對NaNO2的清除作用時認(rèn)為不飽和雙鍵在清除NaNO2時起到了重要作用。而肉豆蔻揮發(fā)油的組成成分復(fù)雜，又含較多萜烯類、烯醇類和酚類等化合物，具有一定還原能力，所以肉豆蔻揮發(fā)油具有清除亞硝酸鹽的能力。

a-水蒸氣蒸餾法；b-纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾法
圖3 兩種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的DSC曲線
Fig.3 DSC diagram of nutmeg volatile oil extracted by two methods

圖4 兩種方法提取揮發(fā)油對NaNO2的清除作用
Fig.4 Scavenging effect of volatile oil extracted by two methods on sodium nitrite

2.8 肉豆蔻揮發(fā)油對阻斷亞硝胺合成作用的影響

由圖5可知，隨著肉豆蔻揮發(fā)油用量的增加，揮發(fā)油對亞硝胺合成的阻斷率增加，當(dāng)用量從100 μg增加至500 μg時，阻斷率隨用量的增加明顯提高，之后隨著揮發(fā)油用量的增加，阻斷率趨于平穩(wěn)。當(dāng)揮發(fā)油用量為800 μg時，兩種方法提取的肉豆蔻精油的阻斷率分別達(dá)到74.80%和76.92%，兩者差異不明顯，整體上來看，后者略大于前者。與清除率相比，阻斷率隨濃度而增加的趨勢更陡峭，但在相同用量下，阻斷率與清除率比較相近。姚新成等[18]報(bào)道了新疆兩色金雞菊揮發(fā)油具有很強(qiáng)抑制亞硝胺形成的能力，其原因是具有抗氧化功能的揮發(fā)油能夠阻斷亞硝酸鹽與次級胺結(jié)合的過程。而現(xiàn)代研究表明，肉豆蔻揮發(fā)油具有一定抗氧化能力[19-20]。由此可知，肉豆蔻揮發(fā)油對亞硝胺的合成具有明顯阻斷作用。

圖5 兩種方法提取揮發(fā)油阻斷亞硝胺合成的能力
Fig.5 The ability of volatile oil extracted by two methods to block the synthesis of nitrosamine

3 結(jié)論

(1)肉豆蔻揮發(fā)油的酶法輔助水蒸氣蒸餾提取與水蒸氣蒸餾提取相比，不僅提取率高，而且還明顯節(jié)約提取時間，降低了能耗。通過對原料微觀結(jié)構(gòu)觀察表明，纖維素酶對原料細(xì)胞壁的水解是促進(jìn)酶法輔助水蒸氣蒸餾快速提取的主要原因。

(2)通過對肉豆蔻揮發(fā)油的感官品質(zhì)、理化性質(zhì)、GC-MS、紅外光譜分析和DSC分析表明，酶法輔助水蒸氣蒸餾提取沒有對肉豆蔻揮發(fā)油的感官品質(zhì)、基本理化性質(zhì)、化學(xué)組成、主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。

(3)兩種方法提取的肉豆蔻揮發(fā)油均有較好的清除NaNO2能力和阻斷亞硝胺合成的作用，且酶法輔助水蒸氣蒸餾法提取的肉豆蔻揮發(fā)油對亞硝酸鹽的清除作用稍強(qiáng)。肉豆蔻揮發(fā)油清除NaNO2能力和對亞硝胺合成的阻斷能力隨著揮發(fā)油用量增加而增強(qiáng)。

因此，酶法輔助水蒸氣蒸餾是提取肉豆蔻揮發(fā)油的有效方法。