葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中的酵母菌篩選及品質(zhì)變化分析

根據(jù)QB/T 5323—2018《植物酵素》規(guī)定，食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類使用的酵素產(chǎn)品。其含多種功效酶[1]，多酚類物質(zhì)[2]，有機(jī)酸、氨基酸以及維生素[3-4]等活性成分，使得食用植物酵素具有潤(rùn)腸通便[1]，清除自由基、抗氧化[4]，解酒護(hù)肝[5]等生理功能。隨著公眾健康意識(shí)的增強(qiáng)，酵素產(chǎn)品倍受推崇。葡萄(Vitis vinifera L.)為葡萄科葡萄屬落葉藤本植物，廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū)[6]。由于其具有較高的食用、藥用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而受到公眾歡迎[7]，據(jù)2019年國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，我國(guó)葡萄年產(chǎn)量達(dá)1 419.54萬(wàn) t。但其季節(jié)性較強(qiáng)，多汁皮薄含糖量高，采后貯藏期短、易腐爛變質(zhì)，因此葡萄采后深加工對(duì)其提高附加值、拓寬市場(chǎng)極為重要，目前產(chǎn)品多以葡萄酒、葡萄干、葡萄果汁等為主。而以葡萄為原料開(kāi)發(fā)新型酵素產(chǎn)品，不僅可以最大限度保留葡萄固有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可增加新的活性成分，是集營(yíng)養(yǎng)、保健、食療等功能于一身的產(chǎn)品，具有廣泛的市場(chǎng)前景[6]。蔣增良等[8-9]通過(guò)研究葡萄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中抗氧化性能的變化及其與有機(jī)酸之間的關(guān)系，表明葡萄酵素在發(fā)酵過(guò)程中具有良好的抗氧化性與自由基清除能力，整體呈上升趨勢(shì)，并且發(fā)現(xiàn)其功能與有機(jī)酸、多酚以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等的協(xié)同作用有關(guān)。但自然發(fā)酵不易控制，易染雜菌且發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，因此安全可控的接種發(fā)酵技術(shù)可為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

目前，研究表明食用植物酵素發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物主要為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[3]。首先，基質(zhì)中的各種微生物及酶類將多糖分解為單糖，葡萄糖在酵母菌作用下轉(zhuǎn)化為乙醇，同時(shí)，也可在醋酸菌的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，并且將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，基質(zhì)糖濃度下降，此過(guò)程伴隨著酶類的釋放，如蛋白酶、淀粉酶以及SOD等，因此酵母菌和醋酸菌在發(fā)酵過(guò)程中具有互利共生關(guān)系[10]。乳酸菌則能產(chǎn)生豐富的有機(jī)酸，改善酵素風(fēng)味，同時(shí)作為有益菌還有維持人體腸道菌群平衡、提高免疫力、促進(jìn)蛋白質(zhì)和鎂元素吸收等作用[4]。LUCENA-PADRS等[11]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技術(shù)研究了西班牙綠橄欖發(fā)酵過(guò)程中的微生物變化，檢測(cè)出乳酸菌、馬內(nèi)桿菌和丙酸桿菌，其中乳酸菌為整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌。王海英[12]利用16S和18S測(cè)序技術(shù)分析了番木瓜自然發(fā)酵過(guò)程中微生物組成，并從中篩選出2株優(yōu)勢(shì)植物乳桿菌菌種以及2株優(yōu)勢(shì)畢赤酵母菌種用于發(fā)酵番木瓜酵素，結(jié)果表明接種發(fā)酵的番木瓜酵素抗氧化能力高于自然發(fā)酵。

本研究通過(guò)探究不同酵母菌發(fā)酵葡萄過(guò)程中物質(zhì)變化規(guī)律，篩選出適合葡萄發(fā)酵的酵母菌，然后將其與醋酸菌、乳酸菌進(jìn)行依次接種發(fā)酵制備葡萄酵素，分析該過(guò)程中γ-氨基丁酸、有機(jī)酸、香氣成分等的變化規(guī)律，旨在明確接種發(fā)酵對(duì)葡萄酵素品質(zhì)的影響，從而為葡萄酵素發(fā)酵條件的優(yōu)化以及品質(zhì)的提升提供理論基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

夏黑葡萄(Summer Black)，河南南陽(yáng)社旗縣；釀酒酵母 CL-13、JL-11、JL-24、XQ-05、發(fā)酵畢赤酵母 CL-03、庫(kù)德里畢赤酵母 CL-19、曼束里卡畢赤酵母 JL-25，河南省工業(yè)微生物菌種保藏中心；巴氏醋桿菌CGMCC 1.41、植物乳桿菌ACCC 11095，北京生物保藏中心。

MRS肉湯(BR)，北京奧博星生物技術(shù)公司；3,5-二硝基水楊酸(AR)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸(HPLC級(jí))，美國(guó)Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯三酚、對(duì)硝基苯酚(HPLC級(jí))，上?？泼軞W公司。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸出粉10，121 ℃下滅菌20 min(固體培養(yǎng)基，再加入15 g/L瓊脂粉)。

許氏醋酸菌種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，酵母浸出粉5，121 ℃下滅菌20 min，冷卻后加入30 mL無(wú)水乙醇。

1.3 儀器與設(shè)備

GC-7890氣相色譜儀、7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1260高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國(guó)Supelco公司；CR-400色差計(jì)，日本柯尼卡美能達(dá)公司；UV-752 N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵基質(zhì)制備

挑選無(wú)機(jī)械傷、病害的新鮮葡萄，洗凈、晾干、打漿后倒入滅菌后的玻璃罐中，添加紅糖至糖度為18 °Bx，用75 mg/mL的果膠酶(酶活力500 U/mg)于50 ℃下酶解40 min。之后100 ℃滅菌15 min[6,13]，為避免轉(zhuǎn)移過(guò)程污染雜菌再置于超凈工作臺(tái)上紫外殺菌15 min，冷卻至室溫，得發(fā)酵基質(zhì)。

1.4.2 酵母菌篩選

1.4.2.1 酵母菌液制備

活化：將甘油管中的7株酵母菌，分別取20 μL涂布于YEPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)36 h，得酵母菌活化液，菌液濃度>106 CFU/mL。

生長(zhǎng)曲線測(cè)定：采用比濁法，將7種酵母菌活化液，分別以3%接種量接種于液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)，并于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h測(cè)定其OD600值，以未接種活化液YEPD培養(yǎng)基為對(duì)照，繪制生長(zhǎng)曲線[14]。

分別將7株酵母菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期的菌液進(jìn)行收集，做接種用酵母菌液。

1.4.2.2 不同酵母菌發(fā)酵

將7種酵母菌液，分別以5%接種量接種于發(fā)酵基質(zhì)中，常溫避光發(fā)酵6 d，每隔1 d取樣，分析不同酵母菌發(fā)酵特性與主要功效酶活性的動(dòng)態(tài)變化。

1.4.3 葡萄酵素制備

將篩選出的酵母菌于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期收集，制備酵母菌液；將前期試驗(yàn)篩選出的醋桿菌、乳桿菌，按1.4.2.1中的方法培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期(醋桿菌于30 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h；乳桿菌于37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)22 h)收集，制備醋酸菌液、乳酸菌液。

將3%酵母菌液接入發(fā)酵基質(zhì)中，發(fā)酵6 d，再接入5%醋酸菌液，發(fā)酵至第27天，過(guò)濾除菌，最后接入3%乳酸菌液，發(fā)酵至第41天。分別于第0、3、6、13、20、27、34、41天取樣。為避免雜菌污染所有操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

1.4.4 發(fā)酵特性測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量[15]；參照陳玉香等[16]的方法測(cè)定乙醇含量；參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》測(cè)定總酸含量；利用酸度計(jì)測(cè)定pH值。

1.4.5 主要功效酶活性測(cè)定

采用GB/T 5009.171—2003中鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性；參照侯曉瑞[17]的方法測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性。

1.4.6 顏色評(píng)估

采用色差計(jì)和CIELab 顏色空間分析顏色變化[18]，其中L*描述從黑色到白色的亮度范圍，a*表示紅色到綠色、b*表示黃色到藍(lán)色的變化情況，色度(CI)為A420、A520和A620之和，色調(diào)(Hue)為A420/A520的比值。

1.4.7 有機(jī)酸含量測(cè)定

樣品前處理：將2.5 mL樣品與1 mL 10.6%的K4Fe(CN)6·3H2O溶液、1 mL 30.0%的ZnSO4溶液混合，用去離子水定容至50 mL，反應(yīng)30 min后取上清液離心，然后經(jīng)0.45 μm膜和C18柱過(guò)濾，待測(cè)[19]。

色譜檢測(cè)條件：色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，進(jìn)樣量10 μL，流速0.9 mL/min，流動(dòng)相0.02 mol/L NaH2PO4(用磷酸調(diào)pH至2.1)，柱溫30 ℃，二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)210 nm[20]。

1.4.8 γ-氨基丁酸含量測(cè)定

參照QB/T 4587—2013《γ-氨基丁酸》中的方法測(cè)定。

1.4.9 香氣成分測(cè)定

采用頂空固相微萃取法對(duì)香氣成分進(jìn)行富集。將7.5 mL樣品、1 g NaCl和25 μL 300 μg/mL的3-辛醇置于20 mL頂空瓶中，40 ℃水浴平衡15 min后插入纖維頭吸附40 min，再放入GC進(jìn)樣器中解析6 min。

檢測(cè)條件參照AUBERT等[21]氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法稍作修改。色譜柱HP-INNOWax毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，烘箱升溫程序：50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至80 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min，注射器溫度240 ℃，載氣(氦氣)流量1.45 mL/min，分流比5∶1，離子源和質(zhì)譜傳輸線溫度分別為240、250 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量范圍33～550 m/z。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 26對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)及LSD、Duncan多重比較分析，采用Origin 2019進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌篩選

2.1.1 不同酵母菌生長(zhǎng)曲線分析

酵母菌生長(zhǎng)曲線一般分為4個(gè)時(shí)期，在制備酵素時(shí)，酵母菌最佳收集菌體接種時(shí)間為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，故通過(guò)測(cè)定7株酵母菌生長(zhǎng)曲線，確定最佳收集菌體接種時(shí)間[22]。由圖1可知，JL-25、CL-03于20 h，JL-11、JL-24、XQ-05、CL-13于14 h，CL-19于16 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期。因此，確定20 h為JL-25、CL-03的收集接種時(shí)間，14 h為JL-11、JL-24、XQ-05、CL-13，16 h為CL-19的收集接種時(shí)間。

圖1 不同酵母菌的生長(zhǎng)曲線
Fig.1 Growth curve of different yeasts

2.1.2 不同酵母菌發(fā)酵特性分析

糖類是酵母菌生長(zhǎng)代謝的主要碳源，通過(guò)糖代謝可生成酒精等代謝產(chǎn)物，還原糖、乙醇含量的變化不僅能反映出微生物生長(zhǎng)代謝情況，還可直接影響產(chǎn)品風(fēng)味[23]。由圖2-a、圖2-b可知，不同酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量逐漸下降，其中JL-11、JL-24、CL-13和XQ-05在發(fā)酵基質(zhì)中適應(yīng)能力強(qiáng)，發(fā)酵速度快，第2天時(shí)含量即趨于0，同時(shí)，酒精度也于第2天達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定；JL-25、CL-3和CL-19適應(yīng)能力弱，發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，還原糖含量分別于第4、5、6天趨于0。不同酵母菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒精含量在8.00%vol左右?？偹岫群蚿H的變化可反映發(fā)酵過(guò)程是否正常。由圖2-c、圖2-d可知，不同酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中總酸度總體呈升高趨勢(shì)，pH值則與之相反，其中釀酒酵母XQ-05相較于其他菌株產(chǎn)酸能力穩(wěn)定，受基質(zhì)酸度影響不大，表現(xiàn)出較強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)酸性能與基質(zhì)適應(yīng)能力，在發(fā)酵第6天時(shí)總酸含量顯著高于其他菌株(P<0.05)且pH最低為3.50。

2.1.3 不同酵母菌主要功效酶活性分析

由表1可知，7株酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中，SOD活力呈先上升后下降再上升趨勢(shì)，下降的原因可能是由于酵母菌正處于快速生長(zhǎng)時(shí)期，密度增高以及衰老時(shí)消耗次級(jí)代謝產(chǎn)物，使得SOD活力降低[24]，其中XQ-05 于第2天達(dá)到最大值58.06 U/mL，其余菌株均在第6天達(dá)到最大值，表明其產(chǎn)酶速度相較于其他菌株快。β-葡萄糖苷酶對(duì)酵素香氣成分的形成有重要作用[25]，由表2可知，不同酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力有顯著差異(P<0.05)，JL-11和JL-24僅在發(fā)酵第2天檢出，CL-19和CL-13在發(fā)酵過(guò)程中未檢出、CL-03和JL-25呈不穩(wěn)定的波動(dòng)趨勢(shì)，而XQ-05在發(fā)酵過(guò)程中β-葡萄糖苷酶活性穩(wěn)步升高，并于第5天增至518.06 μU/mL。這可能是由于不同酵母菌合成、釋放β-葡萄糖苷酶的能力及所處發(fā)酵環(huán)境的影響所導(dǎo)致[17]。

a-還原糖；b-酒精度；c-總酸；d-pH值
圖2 不同酵母菌發(fā)酵過(guò)程中還原糖、酒精度、總酸和pH值的變化
Fig.2 Changes of reducing sugar, alcohol, total acid and pH of different yeasts during fermentation 注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

表1 不同酵母菌發(fā)酵過(guò)程中SOD活力的變化 單位：U/mL

Table 1 Changes of SOD activity of different yeasts during fermentation

注：由Duncan測(cè)驗(yàn)，同一列中不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上有顯著性差異(表2同)

表2 不同酵母菌發(fā)酵過(guò)程中β-葡萄糖苷酶活力的變化 單位：μU/mL

Table 2 Changes of β-glucosidase activity of different yeasts during fermentation

注：n.d表示未檢出(下同)

綜上分析7株酵母菌發(fā)酵過(guò)程中物質(zhì)變化規(guī)律可知，釀酒酵母XQ-05在葡萄基質(zhì)中適應(yīng)性強(qiáng)，發(fā)酵速度快，產(chǎn)酶能力較強(qiáng)且穩(wěn)定，適合葡萄酵素快速發(fā)酵生產(chǎn)，可用于進(jìn)一步研究。

2.2 葡萄酵素品質(zhì)特性分析

將篩選出的釀酒酵母XQ-05與巴氏醋桿菌、植物乳桿菌依次接種發(fā)酵制備葡萄酵素。經(jīng)測(cè)定，發(fā)酵結(jié)束后其各項(xiàng)基本理化指標(biāo)，如還原糖含量0.46 g/L，酒精度(0.47±0.02)%vol，總酸含量(19.09±0.36)g/L，pH(3.19±0.03)等，均滿足QB/T 5323—2018《植物酵素》規(guī)定的要求。

2.2.1 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中顏色的變化

顏色是葡萄酵素最直觀的感官特征，主要呈色物質(zhì)為花色苷，其組成和含量對(duì)酵素色澤有顯著影響，花色苷不穩(wěn)定在發(fā)酵中易受pH值、溫度和微生物等因素的影響，顏色特征能夠反映出酵素發(fā)酵工藝和原料的好壞，也是人們接受度的重要參考指標(biāo)[26]。由表3可知，發(fā)酵過(guò)程中，a*值在0.40～2.15內(nèi)波動(dòng)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)顏色偏紅；b*值在-4.29～2.34內(nèi)變化；第41天時(shí)樣品亮度(L*)顯著的高于其他樣品(P<0.05)。ΔE表示總色差，反映葡萄酵素在發(fā)酵過(guò)程中與葡萄汁相比顏色的變化程度，發(fā)現(xiàn)第41天時(shí)樣品色差最大，其次是第20和27天的樣品，表明接種發(fā)酵改變了葡萄酵素的顏色，這可能是由于發(fā)酵過(guò)程中酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)變和發(fā)酵基質(zhì)酸堿度的變化所導(dǎo)致[27]。葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中CI和Hue呈先降低后升高的趨勢(shì)，與對(duì)照相比，發(fā)酵結(jié)束后色調(diào)升高，色度降低。

表3 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中顏色的變化
Table 3 Changes of color during fermentation of grape Jiaosu

注：由Duncan測(cè)驗(yàn)，同一行中不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上有顯著性差異(表4同)

2.2.2 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中γ-氨基丁酸的變化

γ-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有改善腦功能、降血壓、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌等功能，為新型功能食品因子[3]。由圖3可知，葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中γ-氨基丁酸含量呈逐漸上升趨勢(shì)，發(fā)酵前3 d即酵母菌發(fā)酵前期，γ-氨基丁酸含量增長(zhǎng)速度較快，而后(3～20 d)逐漸減慢，這可能是由于前期酵母菌生長(zhǎng)代謝旺盛，分泌的蛋白酶活性高，故合成γ-氨基丁酸的速率較快，隨著發(fā)酵進(jìn)行，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生乙醇、醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸等代謝產(chǎn)物，使得發(fā)酵基質(zhì)環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致其合成的關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶活性下降，故增加速度減慢[28]。第27天后，隨著乳酸菌發(fā)酵的作用，γ-氨基丁酸含量持續(xù)增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到38.95 μg/mL，顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間樣品(P<0.05)，符合QB/T 5323—2018中規(guī)定的γ-氨基丁酸含量≥0.03 mg/kg的要求。葡萄酵素在接種發(fā)酵過(guò)程中，γ-氨基丁酸主要在酵母菌發(fā)酵階段產(chǎn)生，因此，在后續(xù)優(yōu)化葡萄酵素品質(zhì)時(shí)，可對(duì)酵母菌發(fā)酵階段的參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而提高葡萄酵素γ-氨基丁酸含量。

圖3 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程γ-氨基丁酸的變化
Fig.3 Changes of γ-aminobutyric acid content during fermentation of grape Jiaosu

2.2.3 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中SOD活力的變化

食用植物酵素富含多種功效酶類，例如淀粉酶、蛋白酶和SOD等。其中SOD常被用來(lái)評(píng)價(jià)酵素酶活性的高低[1]。因此，分析葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中SOD活力的變化具有重要意義。如圖4所示，葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中SOD活力整體呈升高趨勢(shì)，分析其原因主要是由于發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)環(huán)境的改變以及微生物不斷分泌相應(yīng)的功效酶等因素，從而使得SOD活力逐漸升高[22]。發(fā)酵前20 d，SOD活力變化不顯著(P>0.05)，為22.89～45.00 U/L；第20～27天時(shí)，SOD活力顯著升高(P<0.05)；接種乳酸菌后，SOD活力持續(xù)升高，于第41天升至135.00 U/L。表明葡萄酵素在依次接種發(fā)酵過(guò)程中SOD活力主要在醋酸菌發(fā)酵后期以及乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中大幅提高，因此，在優(yōu)化葡萄酵素品質(zhì)以及工業(yè)化生產(chǎn)中可針對(duì)性對(duì)發(fā)酵階段進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，從而生產(chǎn)出富含高活性功效酶的產(chǎn)品，提高附加值。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，葡萄酵素SOD活力符合QB/T5323—2018 中≥15 U/L的要求。與葡萄漿汁相比，發(fā)酵結(jié)束時(shí)SOD活力增長(zhǎng)6倍，表明在葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了較多抗氧化酶系，有利于清除活性氧。

圖4 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中SOD活力的變化
Fig.4 Changes of SOD activity during fermentation of grape Jiaosu

2.2.4 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化

有機(jī)酸是酵素發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，可賦予酵素獨(dú)特風(fēng)味，所形成的酸性環(huán)境對(duì)某些有害微生物有抑制作用，并且在發(fā)酵過(guò)程中其種類和數(shù)量也會(huì)發(fā)生變化[29]。因此，研究酵素發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的種類和含量，對(duì)其感官質(zhì)量評(píng)價(jià)極為重要。由表4可知，在發(fā)酵前6 d未檢測(cè)到乙酸，而丙酮酸、檸檬酸和蘋(píng)果酸含量增多，表明這一時(shí)期酵母菌主要通過(guò)糖代謝積累代謝產(chǎn)物；接種醋酸菌后，醋酸菌利用乙醇生成乙酸，乙酸顯著增加(P<0.05)；第27天時(shí)未檢測(cè)出乳酸，乙酸含量顯著升高(P<0.05)，這可能是由于某些微生物具有降解乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸的能力[9]；而接種乳酸菌后，乳酸和檸檬酸含量分別增至102.09 mg/L和67.70 mg/L，蘋(píng)果酸含量下降至0，這可能是由于乳酸菌通過(guò)三羧酸循環(huán)將蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化成檸檬酸、通過(guò)蘋(píng)果酸發(fā)酵途徑將蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化成乳酸所致[30]。

表4 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化
Table 4 Changes of organic acid during fermentation of grape Jiaosu

2.2.5 葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中香氣成分的變化

葡萄酵素香氣成分與原料、菌種和發(fā)酵環(huán)境等多種因素有關(guān)，研究發(fā)酵過(guò)程中香氣成分的變化，對(duì)酵素品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要意義。葡萄酵素發(fā)酵過(guò)程中香氣成分變化的相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211115.2144.004.html)。發(fā)酵過(guò)程中共檢出43種香氣成分，其中醇類化合物和酯類化合物占比較高，香氣成分的種類隨著發(fā)酵時(shí)間而變化。

醇類化合物來(lái)源于酵母菌等微生物分解糖、蛋白質(zhì)及氨基酸等物質(zhì)產(chǎn)生[13]，共檢出14種。其中苯乙醇主要是由酵母菌以L-苯丙氨酸為前體通過(guò)戊糖磷酸途徑或利用葡萄糖通過(guò)草莽酸途徑生成，具有玫瑰香、紫羅蘭香和茉莉花香等多種香味，于第3天顯示出最高的濃度，隨后降低，這可能是由于發(fā)酵后期醇類物質(zhì)與脂肪酸酯化所致[31]。高級(jí)醇是酵母菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括異丁醇、正丁醇、異戊醇、1-戊醇、5-甲基-2-環(huán)己醇、2-庚醇，主要來(lái)自葡萄糖的合成代謝及相應(yīng)氨基酸的分解代謝途徑。酯類化合物構(gòu)成了葡萄酵素的獨(dú)特風(fēng)味，共檢出13種，總體呈先升高后降低的趨勢(shì)，降低的原因可能是由于發(fā)酵后期pH降低，酯類物質(zhì)發(fā)生水解所致[32]。其中乙酸乙酯是葡萄酵素中含量較高的成分，在發(fā)酵第13天檢測(cè)出最高質(zhì)量濃度，為30.07 μg/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)濃度降低，該物質(zhì)廣泛存在于蘋(píng)果、梨等水果中，是構(gòu)成葡萄酵素令人愉悅的花果香氣的主體成分。脂肪酸是構(gòu)成葡萄酵素風(fēng)味的重要化合物，共檢出4種，分別是乙酸、丙酸、異丁酸和異戊酸。乙酸在發(fā)酵過(guò)程中呈先升高后降低的趨勢(shì)，并于第27天檢測(cè)出最高值47.49 μg/mL，可能是因?yàn)檫@一時(shí)期醋酸菌利用乙醇生成大量乙酸。

醛類化合物是構(gòu)成葡萄酵素發(fā)酵前期成熟果味的化學(xué)成分之一，其感官閾值較低，共檢出4種，分別是乙醛、己醛、(2Z)-2-庚醛和反式-2-己烯醛，乙醛在發(fā)酵過(guò)程中呈先升高后降低的趨勢(shì)，己醛、(2Z)-2-庚醛和反式-2-己烯醛僅在葡萄汁中檢測(cè)得到，質(zhì)量濃度為0.03～0.14 μg/mL。酮類化合物在葡萄酵素香氣成分中占比較少，共檢出3種。其中3-羥基-2-丁酮在發(fā)酵后期濃度較大，4-羥基-2-丁酮僅在第27天檢出，2,3-丁二酮在發(fā)酵第34天檢出，3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二酮是醋酸發(fā)酵階段的代表性產(chǎn)物，并且研究指出該物質(zhì)的生成與乳酸有關(guān)[33]。

3 結(jié)論

在分析7株酵母菌發(fā)酵特性及功效酶的動(dòng)態(tài)變化中，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母XQ-05消耗還原糖能力快，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，發(fā)酵速度快，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，因此該菌株能很好地適應(yīng)葡萄基質(zhì)，適合葡萄快速發(fā)酵。在依次接種發(fā)酵葡萄酵素過(guò)程中，相比葡萄漿汁而言，產(chǎn)品偏紅；發(fā)酵過(guò)程中γ-氨基丁酸含量和SOD活力逐漸升高，第41天時(shí)分別達(dá)到38.95 μg/mL和135.00 U/L；有機(jī)酸含量的變化與微生物之間有著密切關(guān)系，造成各微生物發(fā)酵階段有機(jī)酸差異的主要為蘋(píng)果酸、乙酸和乳酸；發(fā)酵過(guò)程中共檢出43種香氣成分，其中醇類化合物和酯類化合物占比較高。本研究明確了不同酵母菌發(fā)酵葡萄過(guò)程中物質(zhì)變化規(guī)律以及接種發(fā)酵過(guò)程中對(duì)葡萄酵素品質(zhì)變化的影響，從而為葡萄酵素發(fā)酵條件的優(yōu)化以及品質(zhì)的提升提供理論基礎(chǔ)。