黑曲霉脂肪酶tabI酶學(xué)性質(zhì)及乳酸乙酯合成能力的研究

酯類物質(zhì)是中國白酒最主要的風(fēng)味物質(zhì)，其含量占風(fēng)味物質(zhì)總量的40%～65%，其中己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯占總酯含量的90%以上，被稱為形成白酒主要風(fēng)味的四大酯[1]。與其他大多數(shù)酯類不同，乳酸乙酯結(jié)構(gòu)中的羥基使其既能溶于乙醇又具有較好的親水特性，在白酒中起到增加醇厚感、協(xié)調(diào)香味和壓水味的作用[2]。在白酒十二大香型中，乳酸乙酯是米香型、豉香型、老白干香型白酒中最重要的酯類物質(zhì)。鄭巖[3]以桂林三花為對象研究了米香型白酒的指紋圖譜，結(jié)果表明其組成成分簡單，所含組分91%以上相似，相對峰面積最大的是異丙醇，其次是乳酸乙酯。楊帥等[4]對清雅型“玉冰燒”白酒酒體風(fēng)格特征進(jìn)行了剖析，結(jié)果表明清雅型“玉冰燒”白酒整體酯類比較單一，以乙酸乙酯和乳酸乙酯為主，且乳酸乙酯和乙酸乙酯的比值(1.3)獨(dú)特。霍麗娜等[5]運(yùn)用氣相色譜技術(shù)分析了老白干原酒的微量成分，結(jié)果表明老白干酒的主要酯類物質(zhì)是乳酸乙酯和乙酸乙酯，且原酒中的乳酸乙酯含量高于乙酸乙酯，乳酸乙酯在總酯中所占比例比其他香型都要高。

在白酒生產(chǎn)過程中，酯類物質(zhì)的合成主要包括微生物代謝生成、有機(jī)化學(xué)反應(yīng)生成和生物酶催化合成3種途徑[6]。王月梅等[7]研究表明清香型酒中乙酸乙酯主要是由大量的生命活動旺盛的生香酵母及產(chǎn)酯霉菌等微生物的代謝生成。張浩等[8]研究表明，在濃香型大曲中己酸乙酯的合成主要以酯化酶催化作用為主，而丁酸乙酯和乳酸乙酯的合成以化學(xué)作用為主。呂云懷等[9]對醬香大曲、濃香大曲和清香大曲中的風(fēng)味物質(zhì)與其產(chǎn)品風(fēng)格特征的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明其只在清香型大曲中檢測到了乳酸乙酯。在以往酯類物質(zhì)合成的研究中，多是圍繞己酸乙酯和乙酸乙酯進(jìn)行的，劉雪等[10]將華根霉麩曲作為粗酶制劑，催化己酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，使酒體中己酸乙酯的含量達(dá)2 302 mg/100mL；潘志友等[11]通過將南極假絲酵母脂肪酶B展示于釀酒酵母細(xì)胞表面，并將該重組釀酒酵母菌體凍干粉作為全細(xì)胞催化劑在非水相中催化合成了己酸乙酯，使其產(chǎn)率達(dá)98%；葛清秀等[12]研究了堿性脂肪酶在正庚烷中催化合成乙酸乙酯，轉(zhuǎn)化率可達(dá)71.4%。

如前所述，老白干香型白酒中乳酸乙酯的含量相對較高，因此本研究擬從老白干香型大曲中分離酯化酶活力較高的黑曲霉菌株，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，從黑曲霉菌株中克隆基因轉(zhuǎn)錄水平較高的脂肪酶基因tabI。然后使其在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達(dá)，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)和合成乳酸乙酯能力的解析，為乳酸乙酯脂肪酶的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(Aspergillus niger)、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α和BL21(DE3)及質(zhì)粒pET28a(+)，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、LA Taq DNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司；同源重組酶，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、小量DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG)、卡那霉素、BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Ni柱、PD-10脫鹽柱，GE公司；C2～C16系列對硝基苯酚羧酸酯、其他生化試劑,均為分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司。

1.3 酯化酶活力的測定

對從老白干香型大曲中分離出來的菌株，進(jìn)行酯化酶活力的測定，具體方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.4 黑曲霉脂肪酶基因的克隆與表達(dá)

1.4.1 基因克隆與重組菌株的構(gòu)建

將從老白干香型大曲中分離出的高酶活力菌株送至北京諾禾致源科技有限公司做轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出基因注釋為脂肪酶且基因轉(zhuǎn)錄水平較高的基因。在NCBI上與A.niger CBS 513.88相對比，獲得基因轉(zhuǎn)錄水平較高基因的開放式閱讀框(open reading frames，ORF)，并送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因合成及密碼子優(yōu)化。將合成后的片段利用PCR技術(shù)從載體pUC57上擴(kuò)增下來并連接至質(zhì)粒pET28a(+)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α穩(wěn)定后，再轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4.2 脂肪酶tabI的制備

將驗(yàn)證成功的重組菌株加入IPTG在20 ℃下誘導(dǎo)20 h后，離心收集菌體，并用pH 7.4的PBS緩沖液重懸菌體。菌體經(jīng)過超聲破碎后，離心獲得含His-tag的融合蛋白上清液。含His-tag的融合蛋白經(jīng)過Ni柱進(jìn)行洗脫，洗脫下來的重組蛋白用PD-10脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，冷凍干燥備用。蛋白質(zhì)濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行測定。

1.5 脂肪酶tabI酶活力的測定與底物特異性分析

脂肪酶酶活力的測定方法參照文獻(xiàn)方法[14-15]，并做改進(jìn)。500 μL的反應(yīng)體系：400 μL、20 mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液、50 μL、5 mmol/L的pNPA和50 μL酶液。30 ℃下反應(yīng)1 min后，在410 nm下測定吸光度值。脂肪酶活力定義為在一定pH和溫度下，1 min催化對硝基苯酚羧酸酯水解生成1 μmol對硝基苯酚的酶量為1個酶活力單位[15-17]。

按照上述方法，分別以7種不同碳鏈長度(C2～C16)的對硝基苯酚羧酸酯為底物，測定脂肪酶tabI酶活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活力[15]。

1.6 脂肪酶tabI動力學(xué)參數(shù)的測定

脂肪酶動力學(xué)參數(shù)根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定。以對硝基苯酚羧酸酯為底物，用無水乙醇配制一系列不同濃度的底物，按照1.5的方法測定不同底物濃度下的脂肪酶tabI酶活力。以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)1/[V]為縱坐標(biāo)作圖，并根據(jù)公式(1)計算得出Km和Vmax[16-19]。

(1)

1.7 脂肪酶tabI酶學(xué)特性分析

按照1.5的方法，對脂肪酶tabI進(jìn)行酶學(xué)特性分析，以最高酶活力為100%計算相對酶活力。

(1)溫度對脂肪酶tabI酶活力的影響：測定20～75 ℃ 的酶活力，每隔5 ℃為檢測點(diǎn)。

(2)pH對脂肪酶tabI酶活力的影響：測定pH 4.5～10的酶活力，pH 4.5～5.5時緩沖液為20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，pH 6.0～7.5時緩沖液為20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH 8.0～9.0時緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，pH 9.5、10.0時緩沖液為20 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液[15-17]。

(3)溫度穩(wěn)定性：將酶液分別在20、30、40、50、60 ℃ 放置0～4 h后，在最適作用條件下測定殘余酶活力。

(4)pH穩(wěn)定性：將酶液分別在pH為6、7、8、9、10環(huán)境下放置0～4 h后，在最適作用條件下測定殘余酶活力。

(5)金屬離子或螯合劑對脂肪酶tabI酶活力的影響：將40 μL酶液與不同的10 μL、1 mmol/L的金屬離子或螯合劑混合，室溫下放置2 h后，在最適作用條件下測定殘余酶活力[16-17]。

(6)有機(jī)溶劑對脂肪酶tabI酶活力的影響：將40 μL的酶液與10 μL不同的有機(jī)溶劑混合，室溫下、150 r/min 振蕩2 h后，在最適作用條件下測定殘余酶活力[16-17]。

1.8 脂肪酶tabI合成乳酸乙酯條件優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[14,20]，以叔丁醇為溶劑，配制不同濃度的乙醇和乳酸溶液，加入一定量的脂肪酶tabI，在40 ℃、150 r/min下反應(yīng)12 h，用氣相色譜法測定乳酸乙酯的含量，對照組加入相同量的高溫滅活酶粉。

氣相色譜檢測條件為：檢測器為FID，色譜柱為HP-INNOWAX(30 m×0.320 mm×0.25 μm)，高純度氮?dú)廨d氣流速設(shè)置為0.8 mL/min，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測器溫度210 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為10∶1。起始色譜柱溫度為50 ℃并維持8 min，然后按照5 ℃/min的速度提升到180 ℃，維持10 min[21-22]。

按照上述方法，優(yōu)化脂肪酶tabI合成乳酸乙酯的反應(yīng)條件。結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組減去對照組的合成量表示。

(1)最佳乙醇濃度的確定：在反應(yīng)體系中，乳酸濃度保持在1.17 mol/L，乙醇濃度分別為8.190、8.775、9.360、9.945、10.530、11.115 mol/L，測定乳酸乙酯合成量。

(2)最佳乳酸濃度的確定：在反應(yīng)體系中，乙醇濃度按照上述實(shí)驗(yàn)獲得的最佳乙醇濃度保持恒定，乳酸濃度分別為0.936、1.170、1.775、2.106、2.340、2.925 mol/L，測定乳酸乙酯合成量。

(3)最佳反應(yīng)時間的確定：在反應(yīng)體系中，乙醇和乳酸濃度按照上述實(shí)驗(yàn)獲得的最佳濃度保持恒定，分別在反應(yīng)時間為2～14 h時取樣檢測乳酸乙酯的合成量，每隔2 h為1個檢測點(diǎn)，測定乳酸乙酯的合成量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯化酶活力測定

對從老白干大曲中分離出的菌株，進(jìn)行了酯化酶活力的測定，結(jié)果見表1，在黑曲霉、黃曲霉、根霉、青霉、紅曲霉中，黑曲霉H7的酯化酶活力是最高的，為1 706.60 U/g，所以選取黑曲霉菌株H7送至諾禾致源公司做轉(zhuǎn)錄組分析。

表1 菌株酯化酶活力的測定結(jié)果
Table 1 The results of the determination of the strain′s esterification enzyme activity

2.2 基因克隆與蛋白的表達(dá)

通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得了9個基因轉(zhuǎn)錄水平較高的脂肪酶基因，按照1.4.1的方法進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，成功構(gòu)建出了重組質(zhì)粒，并將這些重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達(dá)，其中只有一個是可溶性表達(dá)，其余8個均為包涵體，將可溶性表達(dá)的脂肪酶基因與A.niger CBS 513.88相對比，該基因在基因組CBS 513.88中基因序號為An12g04640，命名為tabI。重組質(zhì)粒Pet28a(+)-tabI構(gòu)建流程如圖1所示，經(jīng)過質(zhì)粒酶切驗(yàn)證帶條大小與目的片段一致，如圖2所示。

圖1 重組載體pET28a(+)-tabI構(gòu)建流程圖
Fig.1 The construction flow chart of the recombinant vector pET28a(+)-tabI

M-100 00 marker.1-帶同源臂目的基因825 bp； 2-重組質(zhì)粒EcoR Ι單酶切驗(yàn)證(從上至下條帶大小分別為 5 375 bp和783 bp)
圖2 目的基因和重組質(zhì)粒驗(yàn)證圖譜
Fig.2 The target gene and recombinant plasmid verification map

2.3 脂肪酶tabI的制備

重組菌株BL21-tabI經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的上清液用不同濃度的咪唑洗脫，洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示。在100 mmol/L濃度的咪唑處，出現(xiàn)較濃的單一條帶。脂肪酶tabI的分子質(zhì)量約為29 kDa，與預(yù)測的蛋白分子質(zhì)量一致。圖中重組蛋白tabI破碎后的沉淀中出現(xiàn)了3條較濃條帶，其中上面2條為空質(zhì)粒pET28a(+)的蛋白條帶，第3條蛋白條帶有兩部分來源，一是空質(zhì)粒pET28a(+)的蛋白條帶，二是沉淀中沒有溶解部分脂肪酶tabI的蛋白條帶。

因此，后續(xù)脂肪酶tabI均可以用100 mmol/L濃度的咪唑洗脫，洗脫液用PD-10脫鹽柱進(jìn)行脫鹽后，冷凍干燥備用。脫鹽后的脂肪酶tabI比酶活力為54.34 U/mg。

M-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-空pET28a(+)破碎后的上清液； 2-空pET28a(+)破碎后的沉淀；3-重組蛋白tabI破碎后的上清液； 4-重組蛋白tabI破碎后的沉淀；5-用10 mmol/L咪唑洗脫的 重組蛋白tabI；6-用100 mmol/L咪唑洗脫的重組蛋白tabI
圖3 脂肪酶tabI的SDS-PAGE圖譜
Fig.3 The SDS-PAGE electrophoresis pattern of lipase tabI

2.4 脂肪酶tabI 底物特異性分析及動力學(xué)參數(shù)測定

按照1.5的方法，進(jìn)行脂肪酶tabI底物特異性分析，結(jié)果如圖4所示，脂肪酶tabI偏好于水解短鏈對硝基苯酚羧酸酯，對中長鏈對硝基苯酚羧酸酯基本沒有水解作用，其最適作用底物為對硝基苯酚乙酸酯。

按照1.6的方法，以不同濃度的對硝基苯酚乙酸酯為底物，在40 ℃、pH 8下測定脂肪酶酶活力，采用雙倒數(shù)作圖法，繪制脂肪酶tabI的酶動力學(xué)曲線，可得脂肪酶tabI的Km值為0.85 mmol/L，Vmax值為63.75 mmol/(mL·h)。

圖4 脂肪酶tabI的底物特異性
Fig.4 The substrate specificity of lipase tabI

2.5 脂肪酶tabI酶學(xué)特性分析

2.5.1 脂肪酶tabI最適溫度和最適pH

按照1.7的方法，測定脂肪酶tabI的最適作用溫度和最適作用pH，結(jié)果如圖5所示。由圖5-a可知，脂肪酶tabI的酶活力隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。在40 ℃時，脂肪酶tabI的酶活力最高，表明脂肪酶tabI的最適作用溫度為40 ℃，且在40～55 ℃，脂肪酶tabI的酶活力均保持在60%以上。由圖5-b可知，脂肪酶tabI的酶活力隨著pH的升高而升高，在pH=8時脂肪酶tabI的酶活力最高，之后脂肪酶tabI的酶活力隨著pH的升高而降低，在pH為7～9時tabI的酶活力保持在60%以上。

a-最適溫度；b-最適pH
圖5 脂肪酶tabI的最適溫度和最適pH
Fig.5 The optimum temperature and optimum pH of lipase tabI

2.5.2 脂肪酶tabI的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

按照1.7的方法，測定脂肪酶tabI的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。由圖6-a可知，在30 ℃和40 ℃時，脂肪酶tabI最穩(wěn)定，在4 h內(nèi)殘余酶活力均在80%以上，隨著溫度的升高，酶活力下降速率明顯上升，在20 ℃時，脂肪酶tabI在3 h內(nèi)的殘余酶活力保持在80%以上，在50 ℃和60 ℃時，脂肪酶tabI在3 h內(nèi)的殘余酶活力保持在60%以上。由圖6-b可知，在pH 7、8、9時，脂肪酶tabI最穩(wěn)定，在4 h內(nèi)的殘余酶活力均在80%以上。在pH 6和pH 10時，脂肪酶tabI的穩(wěn)定性下降。

a-熱穩(wěn)定性；b-pH穩(wěn)定性
圖6 脂肪酶tabI的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性
Fig.6 The thermal stability and pH stability of the lipase tabI

2.5.3 金屬離子及螯合劑對脂肪酶tabI活力的影響

表2為金屬離子及螯合劑對脂肪酶酶活力的影響，Zn2+對脂肪酶tabI的酶活力有明顯的促進(jìn)作用，酶活力提高了55.02%；其他金屬離子和螯合劑EDTA 都對酶活力表現(xiàn)為抑制作用，其中K+、Co2+和Fe3+的抑制作用較明顯。

表2 金屬離子及螯合劑EDTA對脂肪酶tabI酶活力的影響
Table 2 The effect of metal ions and chelating agent EDTA on the activity of lipase tabI

2.5.4 有機(jī)溶劑對脂肪酶tabI酶活力的影響

按照1.7的方法，測定有機(jī)溶劑對脂肪酶tabI酶活力的影響，結(jié)果如圖7所示。叔丁醇和乙醇對脂肪酶tabI的酶活力表現(xiàn)出了明顯的促進(jìn)作用，二甲基亞砜、氯仿和正己烷對脂肪酶tabI的酶活力基本沒有影響，丙三醇、二氯甲烷、苯、十二烷和乙醚對脂肪酶tabI 的酶活力有一定的抑制作用，其中苯的抑制作用最明顯。

圖7 有機(jī)溶劑對脂肪酶tabI酶活力的影響
Fig.7 The effect of organic solvents on the activity of lipase tabI

2.6 脂肪酶tabI合成乳酸乙酯條件的優(yōu)化

按照1.8的方法，優(yōu)化脂肪酶tabI合成乳酸乙酯的條件，結(jié)果如圖8、表3所示。

乙醇和乳酸是合成乳酸乙酯的前體物質(zhì)。由圖8-a可知，隨著乙醇濃度的升高，乳酸乙酯的合成量先升高后降低，當(dāng)乙醇濃度為8.775 mol/L 時，乳酸乙酯的合成量達(dá)到最高值，為33.965 mg/L。在達(dá)到最高值后，隨著乙醇濃度的升高，乳酸乙酯的合成量反而減少?？赡艿脑蚴钱?dāng)乙醇濃度過高時對脂肪酶tabI的酶活力有抑制作用，使乳酸乙酯的合成量下降。

a-最佳乙醇濃度；b-最佳反應(yīng)時間
圖8 脂肪酶tabI合成乳酸乙酯的最佳乙醇濃度和 最佳反應(yīng)時間
Fig.8 The best ethanol concentration and best reaction time for the synthesis of ethyl lactate by lipase tabI

如表3所示，隨著乳酸濃度的升高，反應(yīng)體系pH降低，乳酸乙酯的合成量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)乳酸濃度為2.34 mol/L時，乳酸乙酯的合成量最高，為208.49 mg/L。當(dāng)乳酸的濃度繼續(xù)升高時，反應(yīng)體系的pH越來越低，對酶的構(gòu)象產(chǎn)生影響，脂肪酶tabI活力下降，乳酸乙酯合成量減少。

表3 脂肪酶tabI合成乳酸乙酯的最佳乳酸濃度
Table 3 The optimal concentration of lactic acid for the synthesis of ethyl lactate by lipase tabI

圖8-b為反應(yīng)時間與乳酸乙酯合成量的關(guān)系，隨著反應(yīng)時間的增加，乳酸乙酯的合成量逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)達(dá)12 h時，乳酸乙酯的生成量最高，為210.24 mg/L，反應(yīng)時間為14 h時，乳酸乙酯的生成量為209.97 mg/L，乳酸乙酯的生成量減少0.27 mg/L，與12 h比屬誤差范圍。主要原因是酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，隨著時間的推移反應(yīng)趨于平衡。

綜上所述，脂肪酶tabI具有催化合成乳酸乙酯的能力。脂肪酶tabI催化合成乳酸乙酯的最優(yōu)條件為在酸醇比為1∶3.75下，溫度40 ℃、反應(yīng)時間12 h，乳酸乙酯的合成量為210.24 mg/L。

3 結(jié)論與討論

本文對從老白干大曲中分離出的酯化酶活力較高的黑曲霉菌株H0和H7進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，得到了一個在黑曲霉中基因轉(zhuǎn)錄水平較高且功能未知的脂肪酶基因tabI。對該脂肪酶基因進(jìn)行了分子克隆、異源誘導(dǎo)表達(dá)，并首次解析了脂肪酶tabI的酶學(xué)性質(zhì)。經(jīng)過克隆表達(dá)和純化之后，脂肪酶tabI的蛋白分子質(zhì)量約為29 kDa，比酶活力為54.34 U/mg。經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)分析表明，脂肪酶tabI在40 ℃、pH 8的條件下，酶活力最高，說明該酶是一種偏堿性的酶。脂肪酶tabI分別在30、40 ℃和pH 7～9下孵育4 h，殘余酶活力均在80%以上，表明其具有一定的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。該酶催化合成乳酸乙酯的試驗(yàn)表明(表3)，在pH 3.5左右時具有一定的催化能力，在最適條件下乳酸乙酯的合成量為210.24 mg/L，證明其在酸性條件下仍具有一定的合成乳酸乙酯的能力，為乳酸乙酯脂肪酶的開發(fā)和應(yīng)用打下了一定基礎(chǔ)。