黑果腺肋花楸果微乳系統(tǒng)薄層色譜分析及生物自顯影抗氧化活性研究

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott)，又稱不老莓，最早起源于北美東北部，20世紀(jì)90年代引入我國，在食用、藥用、園林、生態(tài)方面均應(yīng)用廣泛[1]，2018年9月國家衛(wèi)健委正式批準(zhǔn)黑果腺肋花楸果為新食品原料[2]。黑果腺肋花楸果實(shí)中主要化學(xué)成分為原花青素、花色苷、黃酮、酚酸等[3]，據(jù)報(bào)道黑果腺肋花楸果實(shí)中花青素、黃酮、多酚含量遠(yuǎn)超其他漿果，甚至是已知植物中含量最高的[4]。近年來發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸果實(shí)及提取物在抗氧化、抗突變、抗炎、抗腫瘤，抗糖尿病以及防治心血管疾病等方面都有顯著作用[5-8]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道了采用pH示差法[9]，高效液相色譜[10]測定黑果腺肋花楸果中花色苷含量；紫外可見分光光度法[11]測定總黃酮含量；Folin-Ciocalteu法[12]測定酚酸類成分，但是到目前為止，還未見高效薄層色譜法同時(shí)測定黑果腺肋花楸果中花色苷、黃酮、酚酸類成分的報(bào)道。

微乳液是由表面活性劑、助表面活性劑、油相和水相按適當(dāng)比例自發(fā)生成的有增溶作用的熱力學(xué)穩(wěn)定體系[13]，以微乳液為展開劑進(jìn)行的薄層色譜分析稱為微乳色譜，目前已應(yīng)用于黃酮、皂苷、生物堿和多糖類等成分的分離鑒定[14]。聚酰胺分子中的酰胺鍵可與酚類、酸類、醌類等化合物形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附解析，因此聚酰胺薄膜已成為黃酮類、酚類、有機(jī)酸、生物堿類等薄層分析方法中的常用固定相[15]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)中考察了傳統(tǒng)硅膠薄層色譜和聚酰胺薄膜結(jié)合微乳系統(tǒng)薄層色譜，發(fā)現(xiàn)聚酰胺薄膜結(jié)合微乳系統(tǒng)薄層色譜比傳統(tǒng)硅膠薄層色譜靈敏度和分離效率要高，重現(xiàn)性好。因此本研究采用聚酰胺-微乳薄層系統(tǒng)結(jié)合高效薄層色譜法(high performance thin layer chromatography，HPTLC)，測定黑果腺肋花楸果中多種成分含量，通過紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visible spectroscopy, UV-Vis)測定其對DPPH自由基的清除能力，通過薄層生物自顯影技術(shù)判定抗氧化活性成分。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

半自動(dòng)點(diǎn)樣儀、SCANNER 3型薄層色譜掃描儀、薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)，瑞士CAMAG；超聲波清洗儀(150 W，40 kHz)，昆山市超聲儀器有限公司；萬分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

黑果腺肋花楸果凍干粉，經(jīng)鑒定為薔薇科腺肋花楸屬植物黑果腺肋花楸的果實(shí)，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，C3G)、金絲桃苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷(cyanidin-3-O-arabinofuranoside，C3A)，北京索萊寶科技有限公司；綠原酸、新綠原酸、維生素C，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基苦基苯肼，梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.3 薄層掃描方法

1.3.1 溶液的制備

1.3.1.1 C3G、金絲桃苷、綠原酸對照品溶液的制備

精密稱取C3G、金絲桃苷及綠原酸對照品適量，加甲醇定容至容量瓶中，配成C3G、金絲桃苷、綠原酸系列質(zhì)量濃度分別為89.42、149.04、248.40、414.00、690.00 μg/mL；5.42、9.03、15.05、25.08、41.80 μg/mL；25.79、42.98、71.64、119.40、199.00 μg/mL的混合溶液，搖勻后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后作為對照品溶液。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

稱取黑果腺肋花楸果凍干粉1.00 g，置棕色容量瓶中，以60%甲醇(經(jīng)0.5% HCl調(diào)節(jié)pH至2～3)為溶劑，料液比1∶10(g∶mL)，40 ℃條件下超聲提取30 min，冷卻至室溫后過濾，濾液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后作為供試品溶液。

1.3.2 色譜程序

使用CAMAG Linomat 5半自動(dòng)斑點(diǎn)采樣器，對聚酰胺薄膜條狀點(diǎn)樣，采樣器的載氣為N2，釋放速率為150 nL/s，對照品與供試品溶液均為2 μL，帶長6 mm，軌道距離8 mm，左右邊距50 mm，條帶間距9 mm。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%含水量微乳-甲酸(9∶1，mL∶mL)為展開劑，在展開缸中飽和10 min后展開，取出，晾干，花色苷類成分在白光下檢視，黃酮類，酚酸類成分先噴2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)甲醇溶液，后噴聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)400甲醇溶液，105 ℃加熱后置于366 nm紫外燈下檢視。使用Reprostar 3薄層色譜儀分別在白光和366 nm紫外燈下檢查和捕獲樣品圖像。使用CAMAG TLC 3掃描儀對對照品和樣品進(jìn)行全波長掃描，距底部的擴(kuò)展距離為90和8 mm，狹縫寬度為6 mm×0.3 mm，掃描速度為20 mm/s。用WinCATS4.04版本TLC在350和550 nm下掃描該聚酰胺薄膜，狹縫寬度為4 mm×0.3 mm，掃描速度為20 mm/s。

1.3.3 方法學(xué)考察

對建立的聚酰胺結(jié)合微乳系統(tǒng)薄層色譜方法進(jìn)行方法學(xué)考察，包括線性、日內(nèi)、日間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性、回收率。

1.3.4 含量測定

對不同批次黑果腺肋花楸果凍干粉樣品中C3G、金絲桃苷及綠原酸進(jìn)行含量測定。

1.4 UV-Vis法測定總抗氧化活性

1.4.1 溶液的制備

1.4.1.1 維生素C對照品溶液的制備

稱取維生素C對照品6.54 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇配成質(zhì)量濃度為0.654 mg/mL的對照品溶液。經(jīng)適當(dāng)稀釋分別配成6.54、13.08、19.62、26.16、39.24、52.32、65.40 μg/mL的溶液。

1.4.1.2 供試品溶液的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將1.3.1.2中供試品溶液經(jīng)稀釋配成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的供試品溶液。

1.4.1.3 DPPH溶液的制備

稱取DPPH對照品4.52 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇配成質(zhì)量濃度為0.045 2 mg/mL的溶液。

1.4.2 DPPH自由基清除率測定

吸取3 mL DPPH溶液與1 mL甲醇混勻后，在最大吸收波長516 nm處測定吸光度A0；吸取DPPH溶液3 mL加入系列對照品或供試品溶液1 mL混勻，避光反應(yīng)0.5 h后，在516 nm處測定吸光度Ai；空白為甲醇3 mL與相對應(yīng)系列對照品或供試品溶液1 mL混勻，避光反應(yīng)0.5 h后在516 nm處測定吸光度Aj，按公式(1)計(jì)算清除率(S)。

(1)

1.5 薄層生物自顯影(TLC Biography,TLC-Bio)分析黑果腺肋花楸果提取物中抗氧化活性成分

1.5.1 溶液的制備

精密稱取C3A，新綠原酸對照品適量，加甲醇配成質(zhì)量濃度為0.2、0.263 mg/mL對照品溶液。

1.5.2 TLC-Bio測定黑果腺肋花楸果提取物中抗氧化活性成分

分別吸取C3G、C3A、新綠原酸、金絲桃苷、綠原酸混合對照品溶液，黑果腺肋花楸供試品溶液各2 μL，按1.3.2方法操作，點(diǎn)樣于a，b兩張聚酰胺薄膜后，展開取出，晾干，不進(jìn)行掃描。將聚酰胺薄膜a先在白光下檢視，再噴顯色劑，先噴2-APB，后噴PEG400，晾干后置紫外366 nm光下檢視，聚酰胺薄膜b晾干后直接噴DPPH甲醇溶液，直到呈現(xiàn)紫色背景，在白光下檢視。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層掃描最大吸收波長的確定

掃描儀對對照品和供試品進(jìn)行掃描后發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸果供試品溶液斑點(diǎn)與對照品斑點(diǎn)比移值相同，光譜圖最大吸收波長一致(圖1)，C3G為550 nm，綠原酸為340 nm，金絲桃苷為370 nm，且波形一致，可以認(rèn)為是同一物質(zhì)。綠原酸與金絲桃苷在350 nm處均有較大吸收，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用雙波長法分別在350、550 nm處對綠原酸，金絲桃苷和C3G進(jìn)行分析。

a-C3G；b-金絲桃苷；c-綠原酸
圖1 最大吸收光譜和化學(xué)結(jié)構(gòu)圖
Fig.1 The maximum absorption spectrum and chemical structure

2.2 方法學(xué)結(jié)果

2.2.1 線性

分別吸取1.3.1.1中C3G、金絲桃苷及綠原酸系列濃度對照品溶液，按1.3.2方法操作，以濃度為x軸，峰面積為y軸，得到對照品C3G，金絲桃苷，綠原酸的線性回歸方程，見表1。

表1 方法的線性關(guān)系考察表
Table 1 Method of linear relation investigation table

2.2.2 日內(nèi)間精密度

分別吸取C3G、金絲桃苷及綠原酸的低、中、高濃度對照品溶液，各重復(fù)3次點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，按1.3.2方法操作，測定C3G、金絲桃苷、綠原酸峰面積計(jì)算日內(nèi)間精密度，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示。日內(nèi)和日間精密度的RSD值如表2所示，結(jié)果表明精密度良好。

表2 日內(nèi)、日間精密度考察表
Table 2 Intraday and inter-day precision investigation table

2.2.3 穩(wěn)定性

按1.3.2方法操作，吸取混合對照品溶液點(diǎn)樣(n=6)于同一聚酰胺薄膜上，分別記錄C3G、金絲桃苷、綠原酸在0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)峰面積并計(jì)算RSD，見表3，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好，C3G、金絲桃苷、綠原酸RSD均<3%。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Table 3 Stability test results

2.2.4 重復(fù)性

按1.3.1.2提取同一批黑果腺肋花楸凍干果粉溶液(n=6)，按1.3.2方法操作，記錄供試品中C3G、金絲桃苷、綠原酸峰面積，經(jīng)計(jì)算RSD均<3%，重復(fù)性試驗(yàn)符合要求(表4)。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
Table 4 Repeatability test results

2.2.5 耐用性

按1.3.2方法操作，改變試驗(yàn)條件包括流動(dòng)相比例(±0.1 mL)、飽和時(shí)間(±2 min)、掃描波長(±2 nm)，記錄峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)和RSD。通過對展開劑比例、飽和時(shí)間、掃描波長進(jìn)行輕微變動(dòng)考察發(fā)現(xiàn)RSD均<3%，結(jié)果見表5。

表5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果
Table 5 Durability test results

2.2.6 回收率

分別吸取供試品溶液適量，加入相當(dāng)于C3G、金絲桃苷、綠原酸0.263、0.105 5、0.568 mg的對照品溶液，混合均勻。按1.3.2方法操作，結(jié)果見表6，C3G、金絲桃苷、綠原酸平均回收率分別為100.6%、100.0%、99.4%；RSD分別為3.4%、2.6%、2.9%，表明該方法回收率良好。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果
Table 6 Recovery test results

2.3 含量測定

按1.3.1.2制備不同批號(hào)黑果腺肋花楸凍干果粉溶液(n=3)，吸取4批供試品溶液點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，通過對比對照品C3G、金絲桃苷和綠原酸與樣品中相應(yīng)斑點(diǎn)的Rf值(分別為0.42、0.33、0.51)確定供試品中相應(yīng)峰，采用外標(biāo)法測定4批供試品中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量(圖2、表7)。

S-混標(biāo)：A-C3G；B-綠原酸；C-金絲桃苷； S1～S4：四批黑果腺肋花楸果
圖2 四批黑果腺肋花楸果薄層色譜圖
Fig.2 Thin-layer chromatogram of four batches of black chokeberry

表7 樣品含量測定結(jié)果 單位：mg/g

Table 7 Results of sample content determination

2.4 DPPH自由基清除率結(jié)果

2.4.1 不同濃度維生素C對DPPH自由基的清除率

由表8可知，維生素C清除50%DPPH自由基質(zhì)量濃度約在14 μg/mL，從圖3看出維生素C對DPPH自由基的清除能力與濃度相關(guān)，一定范圍內(nèi)DPPH自由基清除率隨維生素C濃度增加而增大。文獻(xiàn)也多用此方法測定抗氧化能力，一定程度上表明本方法測定抗氧化能力是可行的。

2.4.2 不同濃度黑果腺肋花楸果對DPPH自由基的清除率

由表9可知，黑果腺肋花楸果提取物濃度約為0.18 mg/mL能清除50%的DPPH自由基，從圖4可看出，清除率隨黑果腺肋花楸果提取物濃度增大而增加，濃度達(dá)1.2 mg/mL時(shí)，清除率為95.90%。

表8 維生素C對DPPH清除結(jié)果
Table 8 The DPPH scavenging rate of vitamin C

圖3 維生素C對DPPH自由基的清除曲線
Fig.3 The Vc scavenging ability toward DPPH

表9 黑果腺肋花楸果對DPPH清除結(jié)果
Table 9 The DPPH scavenging rate of black chokeberry

圖4 黑果腺肋花楸果對DPPH自由基的清除曲線
Fig.4 Scavenging ability of black chokeberry toward DPPH

2.5 TLC-Bio分析黑果腺肋花楸的抗氧化活性成分

由圖5可知，薄層板無抗氧化活性，呈紫色背景，而對照品和供試品顯現(xiàn)黃白色斑點(diǎn)，顯示具有良好的抗氧化活性，說明黑果腺肋花楸中C3G、C3A、金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸都有不同程度的抗氧化活性，除此之外供試品中還含有其他未知抗氧化活性成分，有待于進(jìn)一步分離鑒定。

a-普通色譜圖(Ⅰ白光；Ⅱ 紫外366nm)；b-生物自顯影色譜圖 A-C3G；B-C3A；C-新綠原酸；D-綠原酸；E-金絲桃苷
圖5 生物自顯影色譜圖
Fig.5 TLC-Bio chromatograms

3 結(jié)論與討論

文獻(xiàn)報(bào)道了黑果腺肋花楸果富含花色苷、黃酮、酚酸類成分，前期實(shí)驗(yàn)先采用硅膠薄層色譜與聚酰胺-微乳薄層色譜鑒別指認(rèn)了其中含有C3G、金絲桃苷、綠原酸、蘆丁，發(fā)現(xiàn)聚酰胺-微乳薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度高，因此本研究采用聚酰胺-微乳薄層系統(tǒng)結(jié)合高效薄層色譜建立同時(shí)測定黑果腺肋花楸果實(shí)中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量的方法，4批黑果腺肋花楸果粉中C3G、金絲桃苷、綠原酸含量分別在2.028～3.886，0.092～0.155和0.653～1.058 mg/g，該方法樣品制備簡單，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，證明該方法重復(fù)性好、選擇性強(qiáng)，可作為一個(gè)簡單、快速的半定量方法。

UV-Vis法測定了黑果腺肋花楸果對DPPH自由基的清除率，當(dāng)黑果腺肋花楸果凍干粉經(jīng)超聲醇提，按干重計(jì)算質(zhì)量濃度約為0.18 mg/mL時(shí)可清除50%DPPH自由基，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到1.2 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)95.90%，文獻(xiàn)中報(bào)道的樹莓醇提物、黑果小檗提取物、黑果枸杞水提物的IC50分別約為1.00、0.26、0.42 mg/mL[16-18]，桑葚、藍(lán)莓、黑加侖IC50分別約為0.95、8.91、8.11 mg/mL[19]，作為新食品原料，對于漿果類來說黑果腺肋花楸果對DPPH自由基清除能力強(qiáng)。經(jīng)薄層生物自顯影技術(shù)初步確定黑果腺肋花楸果實(shí)中C3A、C3G、金絲桃苷、綠原酸、新綠原酸均具抗氧化活性，除此之外還存在其他未知抗氧化活性成分，有待于進(jìn)一步分離鑒定。

值得注意的是黑果腺肋花楸果中含有新綠原酸，從薄層色譜圖中看到新綠原酸斑點(diǎn)顏色較深，與綠原酸斑點(diǎn)顏色相近，新綠原酸與綠原酸是同分異構(gòu)體，認(rèn)為對儀器響應(yīng)值一致，因此認(rèn)為含量水平相當(dāng)。新綠原酸除具有抗炎、抗氧化、抗癌[20-22]等活性外，還對醛糖還原酶[23]，流感病毒神經(jīng)氨酸酶[24]等具抑制作用，可用于糖尿病慢性并發(fā)癥以及流感等疾病的防治。

本研究采用黑果腺肋花楸果凍干粉，真實(shí)反映了鮮果中的活性成分，鑒于黑果腺肋花楸果具較好的生物活性，除了在生態(tài)方面，其在飲料、食品、藥品、醫(yī)療保健品等方面都具有較大的開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。