益生菌發(fā)酵藍(lán)莓的體外抗氧化活性分析

藍(lán)莓富含花青素、多酚類等多種活性成分，具有高效清除氧自由基的作用，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的漿果[1]。近年來(lái)，我國(guó)的藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，藍(lán)莓栽培面積和產(chǎn)量均顯著增加，開發(fā)前景巨大，經(jīng)濟(jì)效益可觀。目前，應(yīng)季鮮果是藍(lán)莓的主要消費(fèi)途徑，然而，藍(lán)莓鮮果采摘后感染腐敗微生物的幾率大，不易長(zhǎng)久保存，這對(duì)于拓展藍(lán)莓消費(fèi)市場(chǎng)極為不利。鮮果精深加工是有效延長(zhǎng)藍(lán)莓產(chǎn)品保藏期的重要手段，可延伸藍(lán)莓的產(chǎn)業(yè)鏈，賦予藍(lán)莓更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

微生物發(fā)酵技術(shù)在鮮果加工產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用廣泛，該技術(shù)的蓬勃發(fā)展使其迅速成為藍(lán)莓精深加工的研究熱點(diǎn)[2]。在市場(chǎng)上常見的微生物發(fā)酵加工制成的藍(lán)莓產(chǎn)品有果醋、果酒、酵素、果汁等，這些產(chǎn)品能在蘊(yùn)含藍(lán)莓自然芳香的基礎(chǔ)上，通過(guò)微生物發(fā)酵保留大部分營(yíng)養(yǎng)成分或轉(zhuǎn)化形成新的活性物質(zhì)[3]。益生菌是通過(guò)定殖在人體內(nèi)，改變宿主某一部位菌群組成，對(duì)宿主有益的一類活性微生物，應(yīng)用最廣泛的益生菌有乳酸菌和酵母菌等[4]。目前，益生菌在市場(chǎng)上主要以發(fā)酵乳制品的形式出售，如酸奶等[5]。然而，乳制品中存在致敏原，導(dǎo)致部分消費(fèi)者無(wú)法放心食用，因此，近年來(lái)越來(lái)越多的研究者開展了益生菌發(fā)酵非乳制品的相關(guān)研究[6-7]。果蔬汁具有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、糖、脂肪、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，是開發(fā)非乳制品益生菌飲料的理想基質(zhì)[7-8]。目前，利用益生菌加工藍(lán)莓多見于乳酸菌與酵母菌的發(fā)酵[9]，或者是藍(lán)莓的自然發(fā)酵[10]，而乳酸菌與酵母菌復(fù)合發(fā)酵可進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)品的抗氧化等性能[11-12]。以藍(lán)莓鮮果為原料，經(jīng)益生菌發(fā)酵加工而成的發(fā)酵飲品，是拓展藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的新方向。

因此，本文利用實(shí)驗(yàn)室優(yōu)質(zhì)益生菌(植物乳桿菌Picp-2和單胞釀酒酵母菌ZLG-6)對(duì)藍(lán)莓鮮果進(jìn)行單一和復(fù)合菌種發(fā)酵，以藍(lán)莓鮮果發(fā)酵液的抗氧化活性、酚類物質(zhì)含量和產(chǎn)品感官評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同發(fā)酵方式進(jìn)行評(píng)估。旨在開發(fā)高抗氧化活性的藍(lán)莓發(fā)酵飲品，提高藍(lán)莓鮮果的附加值，豐富藍(lán)莓飲品的種類。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮藍(lán)莓果榨汁(品種為“兔眼”)；乳酸菌：植物乳桿菌Picp-2(菌種保藏號(hào)：M20191045，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)；酵母菌：?jiǎn)伟劸平湍妇鶽LG-6(菌種保藏號(hào)：M20191046，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)；MRS培養(yǎng)基，杭州百思生物技術(shù)有限公司；YPD培養(yǎng)基：酵母提取物1%、葡萄糖2%和大豆蛋白胨2%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將乳酸菌與酵母菌分別在MRS和YPD培養(yǎng)基中活化，當(dāng)OD600值達(dá)到(0.5±0.05)時(shí)，可用于發(fā)酵藍(lán)莓鮮果。

取藍(lán)莓鮮果榨汁，按照200 mL每瓶分裝于250 mL的藍(lán)蓋瓶中，75 ℃條件下處理30 min。按相應(yīng)接種量加入已活化的乳酸菌或酵母菌，混勻，置于培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.2.1 自然發(fā)酵

在30 ℃下進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2 單一菌種發(fā)酵

植物乳桿菌Picp-2接種量10%，在37 ℃下發(fā)酵；單胞釀酒酵母菌ZLG-6的接種量1%，在30 ℃下發(fā)酵。

1.2.3 復(fù)合菌種發(fā)酵

先接入植物乳桿菌Picp-2發(fā)酵3 d(接種量10%，培養(yǎng)溫度37 ℃)，再接入單胞釀酒酵母菌ZLG-6繼續(xù)發(fā)酵10 d(接種量1%，培養(yǎng)溫度30 ℃)。

1.2.4 評(píng)價(jià)與分析

發(fā)酵周期13 d，發(fā)酵結(jié)束得藍(lán)莓發(fā)酵飲品。將藍(lán)莓發(fā)酵飲品離心，測(cè)定抗氧化活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力和酚類物質(zhì)含量。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體外抗氧化能力的檢測(cè)

1.3.1.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定[13]

在1 mL待測(cè)樣品中加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻靜置30 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。用蒸餾水將待測(cè)樣品稀釋成不同的濃度，測(cè)定不同濃度樣品的DPPH自由基清除能力，通過(guò)Origin軟件擬合，計(jì)算IC50值。IC50值定義為當(dāng)清除率為50%時(shí)，1 mL待測(cè)樣品中所含藍(lán)莓發(fā)酵飲品原液的體積(mL/mL)，所需濃度越低，表明該物質(zhì)抗氧化性越強(qiáng)。DPPH自由基清除率A1計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：As，1 mL待測(cè)樣品加1 mL DPPH乙醇溶液的吸光值；Ax，1 mL樣品加1 mL溶劑的吸光值；A0，1 mL DPPH乙醇溶液加1 mL溶劑的吸光值。

1.3.1.2 ·OH清除率的測(cè)定[14]

采用Fenton反應(yīng)法，反應(yīng)體系中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液、待測(cè)樣品或蒸餾水(對(duì)照)各2 mL，靜置10 min后加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，靜置30 min，測(cè)定510 nm波長(zhǎng)下的吸光值。參考1.3.1.1的方法計(jì)算IC50值?！H清除率A2計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0，待測(cè)樣品的吸光值；Ax，蒸餾水(對(duì)照)的吸光值。

1.3.1.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定[15]

各取0.2 mL 7.4 mmoL/L ABTS與2.6 mmoL/L K2S2O8溶液，混勻后暗處反應(yīng)12 h，再用95%乙醇稀釋40～50倍，使該混合液(工作液)在734 nm波長(zhǎng)下的吸光值處于0.68～0.72。將0.8 mL工作液與0.2 mL待測(cè)樣品或95%乙醇(對(duì)照)混勻，靜置6～8 min，測(cè)定734 nm波長(zhǎng)下的吸光值。參考1.3.1.1的方法計(jì)算IC50值。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率A3計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0,待測(cè)樣品的吸光值；Ax，95%乙醇(對(duì)照)的吸光值。

1.3.2 總多酚含量測(cè)定[16]

以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林-西奧卡特法測(cè)定總多酚含量。將0.1 mL待測(cè)樣品與0.05 mL Folin-Ciocalteu試劑混合，反應(yīng)3～8 min后加入0.15 mL質(zhì)量濃度200 g/L的Na2CO3溶液，反應(yīng)60 min后，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光值，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作總多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多酚含量，總多酚的含量以沒食子酸(g/L)表示。

1.3.3 SOD活力檢測(cè)

SOD活力用WST-1法檢測(cè)，參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.4 感官評(píng)分評(píng)價(jià)方法

征求25名志愿者品嘗藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品，從色澤、口味、氣味與體驗(yàn)感4個(gè)方面進(jìn)行獨(dú)立打分，總分10分，評(píng)分細(xì)則參照表1。

表1 藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品評(píng)分細(xì)則
Table 1 Detailed grading rule for probiotics fermented blueberry drinks

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方式對(duì)體外抗氧化活性的影響

氧化損傷是人體衰老的主要原因，還可引起高血脂、糖尿病及心腦血管疾病等。果蔬經(jīng)益生菌發(fā)酵后，其制品的抗氧化能力顯著增強(qiáng)，因?yàn)橐嫔诎l(fā)酵過(guò)程中可水解一些結(jié)合酚，釋放游離酚，提高生物利用率，從而提高抗氧化能力[18]。藍(lán)莓中富含的花青素、多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化性。圖1為不同發(fā)酵方式發(fā)酵飲品的抗氧化能力，圖2為相應(yīng)IC50。

圖1 發(fā)酵方式對(duì)藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品抗氧化能力的影響
Fig.1 Effects of fermentation methods on antioxidant capacity of fermented blueberry drinks

如圖1所示，藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品的DPPH自由基清除率在自然發(fā)酵、乳酸菌、酵母菌與復(fù)合發(fā)酵的條件下，分別為96.65%、98.4%、97.67%和96.76%，其DPPH自由基清除率的IC50值分別為(0.78±0.05)、(0.52±0.06)、(0.56±0.06)和(0.42±0.04)mL/mL(圖2)，說(shuō)明經(jīng)由復(fù)合發(fā)酵所獲得的藍(lán)莓發(fā)酵飲品，其DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)。藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品的·OH清除率在自然發(fā)酵、乳酸菌、酵母菌與復(fù)合發(fā)酵的條件下，分別為80.97%、85.69%、86.36%和85.3%(圖1)，經(jīng)計(jì)算，·OH清除率的IC50值分別為(0.62±0.06)、(0.53±0.04)、(0.52±0.03)和(0.54±0.02)mL/mL(圖2)，說(shuō)明經(jīng)益生菌發(fā)酵后，其·OH清除率相較于自然發(fā)酵狀態(tài)更高，但·OH的清除率在單一菌株發(fā)酵和復(fù)合發(fā)酵的條件下，未見明顯差異。藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率在自然發(fā)酵、乳酸菌、酵母菌與復(fù)合發(fā)酵的條件下，分別為80.64%、86.64%、90.32%和91.76%，其ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的IC50值分別為(0.69±0.02)、(0.58±0.03)、(0.46±0.02)和(0.41±0.03)mL/mL，說(shuō)明相較于自然發(fā)酵，添加益生菌有助于提高藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率，且復(fù)合菌種發(fā)酵的效果優(yōu)于單一菌種發(fā)酵。

發(fā)酵體系的穩(wěn)定性是考量藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品品質(zhì)是否穩(wěn)定的重要因素[19]。從圖1可知，乳酸菌或酵母菌這類經(jīng)由單一菌種發(fā)酵的體系，其穩(wěn)定性顯著優(yōu)于自然發(fā)酵或復(fù)合發(fā)酵的體系。說(shuō)明在發(fā)酵體系中添加益生菌使其成為優(yōu)勢(shì)菌種，更有利于發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性；復(fù)合發(fā)酵體系的穩(wěn)定性低于單一菌種發(fā)酵，推測(cè)發(fā)酵體系中菌種的種類越復(fù)雜，其穩(wěn)定性控制的難度越高。

圖2 不同發(fā)酵方式下藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品清除 自由基的IC50值
Fig.2 IC50 values of free radical scavenging rates of fermented blueberry drinks using different fermentation methods

2.2 不同發(fā)酵方式對(duì)SOD活力的影響

SOD是機(jī)體內(nèi)能夠清除超氧陰離子自由基的預(yù)防型抗氧化劑，可用于衡量機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱[20]。藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品在自然發(fā)酵、乳酸菌、酵母菌與復(fù)合發(fā)酵的條件下，其SOD活力分別為255.23、296.31、261.04、300.93 U/mL(圖3)。結(jié)果表明，益生菌的發(fā)酵過(guò)程可促進(jìn)藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品SOD活力的增加，尤其是乳酸菌的添加可顯著提高發(fā)酵體系中SOD活力水平[21]。

圖3 發(fā)酵方式對(duì)藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品SOD活力的影響
Fig.3 Effects of fermentation methods on SOD activity of fermented blueberry drinks

2.3 不同發(fā)酵方式對(duì)總多酚含量的影響

植物多酚具有抗癌、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化等多種生物活性，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)視力、改善弱視、抗氧化、保護(hù)人體免受自由基的損傷等方面效果顯著[22]。從圖4可知，藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品在自然發(fā)酵、乳酸菌、酵母菌與復(fù)合發(fā)酵的條件下，其總多酚含量分別為6.82、6.16、6.84、7.07 g/L，與自然發(fā)酵相比，乳酸菌發(fā)酵的體系中其總多酚含量顯著降低，酵母菌發(fā)酵的體系未見明顯差異，但復(fù)合發(fā)酵體系中的總多酚含量高于自然發(fā)酵，推測(cè)藍(lán)莓鮮果在乳酸菌與酵母菌的協(xié)同作用下，可提高該發(fā)酵飲品中的總多酚含量。

圖4 發(fā)酵方式對(duì)藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品總多酚含量的影響
Fig.4 Effects of fermentation methods on the content of total polyphenols in fermented blueberry drinks

2.4 不同發(fā)酵方式對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響

由圖5可知，藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品在自然發(fā)酵、乳酸菌、酵母菌與復(fù)合發(fā)酵的條件下，其感官評(píng)分分別為4.68、8.66、8.35和8.98，說(shuō)明在藍(lán)莓鮮果發(fā)酵過(guò)程中添加益生菌，可有效地提高發(fā)酵飲品的感官評(píng)價(jià)，尤其是乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)，可賦予發(fā)酵飲品更怡人的感官享受。

圖5 發(fā)酵方式對(duì)藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品感官評(píng)價(jià)的影響
Fig.5 Effects of fermentation methods on sensory evaluation of fermented blueberry drinks

3 結(jié)論

以榨汁的藍(lán)莓鮮果為原料，利用本研究室篩選的植物乳桿菌Picp-2和單胞釀酒酵母菌ZLG-6制備藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品，通過(guò)比較飲品的抗氧化性能、SOD活力、總多酚含量和感官評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合發(fā)酵的方式優(yōu)于自然發(fā)酵和單一菌種發(fā)酵，是最適于加工藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品的工藝。該工藝條件下，藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品的DPPH自由基清除率為96.76%(IC50值為0.42 mL/mL)、·OH清除率為85.30%(IC50值為0.54 mL/mL)、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率為91.76%(IC50值為0.41 mL/mL)、SOD活力為300.93 U/mL、總多酚含量為7.07 g/L、感官評(píng)分為8.98。本研究確定了藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品的最佳發(fā)酵方式，獲得了一款具有高抗氧化性能的富營(yíng)養(yǎng)藍(lán)莓飲品，為深入研究藍(lán)莓鮮果發(fā)酵飲品的制備工藝奠定了理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。