蛋白酶輔助法腐乳發(fā)酵工藝優(yōu)化和理化性質(zhì)分析

腐乳是我國具有民族特色的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品，因其味道鮮美，具有抗氧化和降血壓等保健功能，深受消費者歡迎[1-3]。腐乳的發(fā)酵過程分為前發(fā)酵和后發(fā)酵[4]，其中主要發(fā)生了生物化學(xué)和物理化學(xué)變化[5]。腐乳的前發(fā)酵是培養(yǎng)菌系和積累酶系的過程，一般為36～48 h；后發(fā)酵是酶系作用于腐乳毛坯的過程，其毛坯中毛霉分泌蛋白酶降解大豆蛋白，從而破壞凝膠結(jié)構(gòu)使其質(zhì)地軟化并產(chǎn)生大量游離氨基酸等。該過程需要較長的后熟時間，一般為3～6個月，因此制約了其在我國的工業(yè)化生產(chǎn)[6-7]。

近年來，針對縮短腐乳生產(chǎn)周期的研究較多。其中，在后發(fā)酵階段直接加入外源蛋白酶是一種較便捷的方法。此外，腐乳后發(fā)酵溫度也在很大程度上影響腐乳的發(fā)酵周期，而如今對酶法輔助腐乳發(fā)酵中溫度影響的研究較少。本研究通過控制酶促腐乳后發(fā)酵的溫度，對腐乳發(fā)酵過程中理化性質(zhì)變化進(jìn)行研究，了解溫度對蛋白酶輔助腐乳發(fā)酵的影響，旨在為優(yōu)化酶促腐乳工藝提供一定的理論和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽鹵型豆腐、食鹽、白酒(均為食品級)，市售；雅致放射性毛霉菌粉，安琪酵母股份有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(活性單位：1×105 U，均為食品級)，滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；冰乙酸、無水乙酸鈉、乙酰丙酮、硫酸銨、37%甲醛，阿拉丁工業(yè)公司。

恒溫培養(yǎng)箱，上?；厶﹥x器制造有限公司；冷凍干燥機，美國Labconco公司；糖度儀，ATAGO(愛拓)中國分公司；酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；高速離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；組織研磨儀，上海凈信科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶促腐乳的生物釀制

將鹽鹵型老豆腐切成約2 cm×2.5 cm×2.5 cm的小塊，噴灑雅致放射毛霉菌懸液至終濃度約為1×107 CFU/mL，在25 ℃下前發(fā)酵3 d后搓毛；毛坯稱重后，按質(zhì)量比加入10%的食鹽腌制22 h，制得咸坯；咸坯稱重后，均勻分成11份，根據(jù)表1加入不同外源蛋白酶處理并裝瓶，其總添加量為腐乳總蛋白的4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；最后加入10%食用乙醇至完全浸泡咸坯后加蓋密封，分別在20、30、37、50 ℃下后發(fā)酵20 d[8]。

表1 添加外源蛋白酶樣品分組
Table 1 Grouping of samples with exogenous protease

1.2.2 腐乳的樣品采集及預(yù)處理

樣品采集：每個酶促腐乳樣品的前發(fā)酵全部天數(shù)以及后發(fā)酵1、2、3、5、10、20 d中取樣用于理化特性分析。

預(yù)處理：將腐乳在無菌條件下進(jìn)行取樣，于-18 ℃冰箱保存待用；取固體樣品于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍24 h，于真空冷凍干燥機中干燥24 h，將干燥好的樣品碾碎過40目篩，進(jìn)行稱重、研磨、離心并取上清液為液體樣品于4 ℃冰箱保存，現(xiàn)配現(xiàn)用[9-10]。

1.2.3 腐乳的pH值和可溶性固形物含量測定

pH計測定腐乳樣品pH值，并使用ATAGO數(shù)顯糖度儀測定液體樣品的可溶性固形物含量。

1.2.4 腐乳的氨基態(tài)氮含量測定

精密吸取氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL管中，向各管分別加入4 mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4 mL顯色劑，用水稀釋至刻度并混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出后水浴冷卻至室溫并于400 nm處測量吸光度，以氨氮含量(μg)為橫坐標(biāo)，OD400為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品稀釋液于相同操作測量吸光度，從而計算樣品含量[11]，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：X，氨基酸態(tài)氮含量，mg/g；m，氮的質(zhì)量，μg；V，吸取試樣的體積，mL；V1，測定用試樣的體積，mL；V2，試樣前處理中的定容體積，mL；0.01，樣品含量，mL/mg；100，單位換算系數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計分析方法

所有試樣測定3個平行樣品，并采用Excel 2010和Origin 8.6軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度發(fā)酵過程中腐乳樣品氨基態(tài)氮變化

不同發(fā)酵工藝的腐乳產(chǎn)品品質(zhì)差異較大。其中，氨基態(tài)氮與游離氨基酸含量成正比關(guān)系，是腐乳成熟的重要指標(biāo)[12-15]。本研究通過控制不同后發(fā)酵溫度，分析其對酶促腐乳氨基態(tài)氮含量的影響。圖1～圖4結(jié)果顯示，在發(fā)酵的整個過程中，腐乳的氨基態(tài)氮含量先上升后趨于穩(wěn)定。根據(jù)國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10170—2007《腐乳》的規(guī)定[11],白腐乳的氨基態(tài)氮含量不小于0.35%，其中各組腐乳后發(fā)酵20 d均符合該標(biāo)準(zhǔn)。前發(fā)酵階段，毛霉生長旺盛且產(chǎn)生大量蛋白酶，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量激增[12]；后發(fā)酵初期，由于鹽分的滲透和水分的析出以及對測定方法的影響，鹽坯中氨基態(tài)氮含量呈急劇下降；后發(fā)酵3～10 d時，坯體中氨基態(tài)氮含量整體呈上升趨勢，主要歸因于前發(fā)酵時毛霉產(chǎn)生的蛋白酶繼續(xù)分解蛋白質(zhì)成多肽，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量持續(xù)增加；在后發(fā)酵10～20 d時，由于水解產(chǎn)物的累積、鹽抑制使蛋白酶活力下降，蛋白質(zhì)酶解作用減弱，氨基態(tài)氮含量基本處于波動平穩(wěn)狀態(tài)[16]。

2.1.1 20 ℃后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化

控制后發(fā)酵溫度為20 ℃屬于低溫發(fā)酵，低溫發(fā)酵有助于控制生物安全性以及腐乳的酸敗，減少對后發(fā)酵階段高鹽條件的依賴[17]，但同時會降低發(fā)酵過程中的產(chǎn)酶水平和酶活性，延長腐乳成熟周期從而不利于其生產(chǎn)效率。圖1顯示，對照組樣品的氨基態(tài)氮含量上升極為緩慢，后發(fā)酵20 d其氨基態(tài)氮含量最低僅有4.33 mg/g。同樣條件下，各酶促腐乳組別氨基態(tài)氮含量均比對照組高。多組腐乳氨基態(tài)氮在20 d左右達(dá)到9 mg/g以上，基本發(fā)酵成熟[4]。其中第5組(2%中性蛋白酶+2%堿性蛋白酶)和第2組(4%堿性蛋白酶)的氨基態(tài)氮含量較高，分別達(dá)到9.60、9.51 mg/g。結(jié)果顯示，添加外源蛋白酶有效解決了低溫蛋白質(zhì)降解和腐乳熟化的問題，證明了腐乳的酶法輔助低溫發(fā)酵工藝的可行性，為腐乳發(fā)酵工藝研究提供了新的方向。

圖1 20 ℃后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化
Fig.1 Changes of amino nitrogen content in sufu samples post-fermented at 20 ℃

2.1.2 30 ℃后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化

由圖2顯示，該溫度下各組腐乳氨基態(tài)氮含量存在一定差異。其中，第2組(4%堿性蛋白酶)和第5組(2%中性蛋白酶+2%堿性蛋白酶)的氨基態(tài)氮含量較高，分別為9.51、9.02 mg/g，最低為對照組僅有4.26 mg/g。后發(fā)酵溫度的升高對腐乳中氨基態(tài)氮含量起促進(jìn)作用[2]，而30 ℃下各組腐乳的氨基態(tài)氮含量變化趨勢與20 ℃條件下相近甚至相對較低，推測使用不同批次腐乳使得結(jié)果受到一定程度的影響。

圖2 30 ℃后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化
Fig.2 Changes of amino nitrogen content in sufu samples post-fermented at 30 ℃

2.1.3 37 ℃后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化

由圖3可得，該溫度下各組腐乳氨基態(tài)氮含量呈快速上升趨勢，在后發(fā)酵10 d左右其氨基態(tài)氮含量均已達(dá)標(biāo)且腐乳已基本成熟，之后均趨于平緩。37 ℃后發(fā)酵溫度接近復(fù)合蛋白酶的最佳溫度，活性達(dá)到最佳狀態(tài)，也使腐乳中蛋白質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)疏松，從而暴露出更多的酶作用位點[17-18]。各組腐乳氨基態(tài)氮含量仍存在一定差異。其中，第9組(2%堿性蛋白酶+2%木瓜蛋白酶)氨基態(tài)氮含量最高達(dá)到12.27 mg/g，對照組僅為4.26 mg/g，表明在37 ℃后發(fā)酵溫度下添加外源蛋白酶對腐乳成熟起到極大的促進(jìn)作用，縮短了發(fā)酵周期使得發(fā)酵12 d左右氨基態(tài)氮含量達(dá)到較穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 37 ℃后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化
Fig.3 Changes of amino nitrogen content in sufu samples post-fermented at 37 ℃

2.1.4 50 ℃后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化

由圖4可得，該溫度下各組腐乳氨基態(tài)氮含量上升較緩并存在下降趨勢，相較于后發(fā)酵溫度為37 ℃的氨基態(tài)氮含量少。后發(fā)酵溫度50 ℃屬于高溫發(fā)酵，高溫導(dǎo)致酶蛋白發(fā)生部分變性，從而使反應(yīng)速率有所下降[19]；另外，高溫還會影響氨基化合物如氨基酸和多肽等的穩(wěn)定性和其他化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量的下降，體現(xiàn)在多組腐乳樣品在后發(fā)酵10～20 d的氨基態(tài)氮含量均有明顯的下降趨勢。各組腐乳氨基態(tài)氮含量變化趨勢較雜亂，但添加外源蛋白酶的組別氨基態(tài)氮含量仍高于對照組。其中，第8組(2%堿性蛋白酶+2%胰蛋白酶)和第2組(4%堿性蛋白酶)的氨基態(tài)氮含量較高，分別達(dá)到10.50、10.35 mg/g，對照組最低為4.65 mg/g。

圖4 50 ℃后發(fā)酵溫度腐乳樣品的氨基態(tài)氮變化
Fig.4 Changes of amino nitrogen content in sufu samples post-fermented at 50 ℃

結(jié)果表明，添加外源蛋白酶的組別氨基態(tài)氮含量均高于不加酶的對照組，有利于縮短腐乳生產(chǎn)周期。在一定范圍內(nèi)，隨著后發(fā)酵溫度的升高，氨基態(tài)氮含量有明顯的增加。通過不同酶處理，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對低溫有更好的適應(yīng)性，在20、30 ℃后發(fā)酵條件下起到明顯的促蛋白酶解作用；而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶最適溫度范圍相對較高，更適于37、50 ℃后發(fā)酵條件，且復(fù)合酶的效果優(yōu)于單一酶作用。

2.2 不同溫度發(fā)酵過程中腐乳樣品pH變化

發(fā)酵過程中pH值是微生物在特定環(huán)境下代謝活動的綜合指標(biāo)，影響腐乳pH值變化的因素主要有氨基態(tài)氮含量和總酸含量[19]。從圖5可以看出，腐乳的發(fā)酵過程總體呈先下降后上升再下降后平穩(wěn)趨勢，且不同發(fā)酵溫度下各組pH值的變化規(guī)律基本一致[20-21]。前發(fā)酵階段，pH值先下降后迅速升高，初期毛霉處于生長延滯期豆腐水分被消耗導(dǎo)致pH下降，之后毛霉基本處于生長平穩(wěn)期，大量毛霉菌體生長消耗了以豆腐為基礎(chǔ)的碳源和氮源，生成了諸如生物胺等的堿性物質(zhì)導(dǎo)致pH升高。后發(fā)酵階段，毛霉產(chǎn)生大量蛋白酶分解蛋白生成各種酸性氨基酸以及碳水化合物、脂肪酸的分解，乳酸菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機酸導(dǎo)致pH值呈下降趨勢。隨著發(fā)酵時間的增長，水解產(chǎn)物氨基酸的進(jìn)一步脫氨基作用產(chǎn)生氨[22],對pH值產(chǎn)生一定的影響。由圖5-a和圖5-b可得，其pH值最終分別穩(wěn)定在6.0～6.4，在酶法輔助腐乳低溫發(fā)酵條件下，各組腐乳pH值均符合標(biāo)準(zhǔn)；由圖5-c顯示，37 ℃后發(fā)酵溫度下各組腐乳pH值穩(wěn)定在5.8～6.2；而圖5-d中50 ℃后發(fā)酵溫度各組pH值則穩(wěn)定在5.5左右。

a-后發(fā)酵溫度20 ℃；b-后發(fā)酵溫度30 ℃；c-后發(fā)酵溫度37 ℃；d-后發(fā)酵溫度50 ℃
圖5 不同蛋白酶處理腐乳pH的變化
Fig.5 Changes of pH in sufu treated with different proteases

結(jié)果表明，不同后發(fā)酵溫度下腐乳的pH始終呈酸性，且酶促腐乳組別的pH值一般高于對照組，這是由于外源蛋白酶的添加可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物氨基酸快速分解，使得pH升高[23-24]。隨著后發(fā)酵溫度的增加，腐乳pH值有下降趨勢，可能的原因包括在高溫下易滋生細(xì)菌產(chǎn)生多種酸性雜質(zhì)，以及高溫條件下氨基化合物的分解等。此外，在酶促腐乳低溫發(fā)酵下，保證了腐乳的酸度以及安全性；而在高溫條件下，大大增加了腐乳的酸性。

2.3 不同溫度發(fā)酵過程中腐乳樣品可溶性固形物變化

可溶性固形物是腐乳滋味的主要來源，跟蹤檢測腐乳發(fā)酵過程中的可溶性固形物含量對于判斷腐乳的成熟有重要意義[25]。由圖6可知，腐乳可溶性固形物含量整體呈波動上升后平穩(wěn)趨勢，且不同溫度下可溶性固形物含量變化規(guī)律趨于一致。前發(fā)酵階段，毛霉在大量累積蛋白酶，故可溶性固形物含量趨于平穩(wěn)且緩慢增加。后發(fā)酵初期，腐乳中的不溶性物質(zhì)被蛋白酶分解生成水溶性物質(zhì)；后發(fā)酵后期，水解產(chǎn)物的累積以及原料的減少使得蛋白酶活性受到抑制，使得可溶性固形物含量變化趨于平穩(wěn)。不同后發(fā)酵溫度處理下樣品中可溶性固形物含量最高均處于6.0%～6.4%，最低為對照組均僅有4.3%～4.8%。其中，中性蛋白酶和堿性蛋白酶體現(xiàn)了其促熟的優(yōu)越性。結(jié)果表明，酶促腐乳組由于外源蛋白酶分解了更多的不溶性蛋白質(zhì)，從而使得酶促腐乳組可溶性固形物含量均高于對照組；可溶性固形物包括糖、氨基酸、脂肪酸等，故可溶性固形物含量的變化規(guī)律與氨基態(tài)氮含量具有相似性。

a-后發(fā)酵溫度20 ℃；b-后發(fā)酵溫度30 ℃；c-后發(fā)酵溫度37 ℃；d-后發(fā)酵溫度50 ℃
圖6 不同蛋白酶處理腐乳可溶性固形物的變化
Fig.6 Changes of soluble solids in sufu treated with different proteases

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果顯示，可溶性固形物與氨基態(tài)氮含量變化規(guī)律具有相似性，各酶促腐乳組別均高于不加酶的對照組。不同溫度下，氨基態(tài)氮含量最高分別達(dá)到9.6、9.57、12.27、10.50 mg/g，最低為4.26～4.65 mg/g，最高含量為最低含量的2～3倍左右；可溶性固形物含量最高在6.0%～6.4%，最低在4.3%～4.8%，表明外源蛋白酶的添加有利于縮短發(fā)酵周期，利用添加外源蛋白酶來優(yōu)化腐乳發(fā)酵工藝具有一定的可行性。隨著發(fā)酵溫度的升高，兩者均有上升趨勢，但在高溫條件下會影響酶活性，導(dǎo)致氨基態(tài)氮含量降低。對比不同后發(fā)酵溫度，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對低溫有更好的適應(yīng)性，在20、30 ℃后發(fā)酵條件下起到明顯的促蛋白酶解作用，而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶最適溫度范圍相對較高，更適于37、50 ℃后發(fā)酵條件。同時，復(fù)合酶在對腐乳的促熟作用中體現(xiàn)出一定的優(yōu)越性。在腐乳后發(fā)酵過程中，酶促腐乳pH值始終高于不加酶的對照組，隨著溫度的升高，腐乳pH值呈下降趨勢。

基于低溫后發(fā)酵有利于腐乳的保藏并防止腐敗，低溫酶輔助法的腐乳發(fā)酵工藝可能在制備低鹽腐乳方面具有一定優(yōu)勢[26]。同時，添加蛋白酶(尤其是復(fù)合蛋白酶)能有效解決低溫蛋白質(zhì)降解和腐乳熟化的問題，并且20 ℃酶促腐乳的成熟速度與30 ℃條件下相似，使低溫發(fā)酵酶促腐乳更具可行性，由此可促進(jìn)改善腐乳的品質(zhì)和降低腐敗風(fēng)險。因此，根據(jù)此次研究確定低鹽腐乳后發(fā)酵最佳工藝為：溫度20 ℃，蛋白酶添加量為2%中性蛋白酶+2%堿性蛋白酶。