雙孢蘑菇采后品質劣變過程中風味物質的變化規(guī)律

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)味道鮮美，營養(yǎng)豐富，以良好的風味和保健功效在全球食用菌生產和消量中占比非常高[1-2]。但在采后流通環(huán)節(jié)中因環(huán)境變化等因素造成其生理失調和代謝紊亂的現(xiàn)象，使其風味劣變，嚴重影響其商品價值，已成為制約鮮菇產業(yè)發(fā)展的瓶頸[3-4]。

目前，食用菌風味物質方面的研究多集中于對揮發(fā)性風味成分的研究，例如FANG等[5]通過固相微萃取/氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry technology，SPME/GC-MS)對納米包裝和普通聚乙烯包裝金針菇揮發(fā)性風味成分進行比較，結果表明納米包裝能更好地維持金針菇原有的風味；何奎等[6]通過對真姬菇的揮發(fā)性成分進行分析檢測，發(fā)現(xiàn)真姬菇采后貯藏過程中1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、正辛醛是其主要的特征風味物質。食用菌的風味品質主要由揮發(fā)性的風味物質和非揮發(fā)性呈味物質共同組成，其中風味物質主要是由含有8個碳的化合物及其衍生物以及醇、酮、醛等揮發(fā)性風味成分組成，這些化合物主要是由其內部的脂氧合酶和氫過氧化物裂解酶催化亞油酸形成的產物，具有濃郁的蘑菇味[7-8]；TSAI等[9]在研究姬松茸、茶樹菇和牛肝菌中非揮發(fā)性風味成分過程中發(fā)現(xiàn)游離氨基酸、呈味核苷酸和有機酸等非揮發(fā)性風味成為蘑菇提供特有的鮮味和甘甜味，而核苷酸和有機酸可為其采后的呼吸作用提供所需的能量。但有關雙孢蘑菇采后品質劣變過程中的揮發(fā)性風味物質和非揮發(fā)性的呈味物質的變化規(guī)律鮮有報道。

為此，本研究基于雙孢蘑菇采后工廠化流通技術體系，運用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀和高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術動態(tài)跟蹤分析雙孢蘑菇采后品質劣變過程風味變化規(guī)律，以期從風味品質的角度為雙孢蘑菇采后品質劣變進程進行判斷，為雙孢蘑菇采后的品質快速檢測和風味鑒定提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇：試驗所用雙孢蘑菇(A.bisporus A15)，甘肅金沃森生物科技有限公司(中國 甘肅 靈臺)種植的一潮菇。

試劑：5′-呈味核苷酸(5′-CMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP和5′-AMP)標品，有機酸(檸檬酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸)標準品均分析純，購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

雙孢蘑菇采后挑選蓋3～5 cm，大小均勻，顏色潔白，無機械損傷的子實體置于溫度為(17±1) ℃、相對濕度為85%～90%的環(huán)境菇房中在放置6 d，用于取樣和檢測。分別于0、3和6 d進行取樣。

1.2.2 揮發(fā)性風味測定

揮發(fā)性風味物質參照裴斐[10]的方法進行測定；定性與定量分析參照何奎等[6]的方法進行分析；特征揮發(fā)性物質的評價參照劉登勇等[11]的方法進行評價。

1.2.3 非揮發(fā)性風味檢測

游離氨基酸和呈味核苷酸參考馬寧等[12]的方法進行測定；有機酸參考LI等[13]的方法進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和繪制圖表，利用Heatmap 軟件進行風味熱圖可視化，SPSS 19.0 進行顯著性差異及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 揮發(fā)性化合物種類及含量變化

雙孢蘑菇采后品質劣變過程中揮發(fā)性風味物質的種類、總離子流圖及含量如圖1、表1所示。由圖1-a可知，醛類物質的種類隨著采后時間的延長先減少后增加；醇類物質的種類逐漸增加；酮類物質的種類逐漸增加，酯類物質的種類在采后品質劣變前保持不變，品質開始發(fā)生劣變后逐漸增加；呋喃類的種類在整個品質劣變過程中期保持不變；由圖1-b可知，在雙孢蘑菇采后品質劣變過程中，在同一保留時間，其離子強度(峰高)是不同的，表明同一種揮發(fā)性物質在采后品質劣變過程中的含量不同；在同一時期，不同保留時間的離子強度(峰高)不同，表明不同的揮發(fā)性物質在同一時期的含量也不同。由表1可知，在雙孢蘑菇采后品質劣變過程中共檢測出38種揮發(fā)性物質，其中醛類9種、醇類13種、酮類9種、酯類6種、及呋喃類1種。雙孢蘑菇中揮發(fā)性物質含量與種類的多少并不能決定其對風味的貢獻度的大小，而是由揮發(fā)性物質的濃度及感覺閾值共同決定[14]。

2.2 雙孢蘑菇采后品質劣變過程中揮發(fā)性物質熱圖分析

為了更進一步明確雙孢蘑菇采后品質劣變過程中揮發(fā)性風味物質的變化，我們對香氣含量取以10為底的對數(shù)，進行熱圖聚類分析，結果如圖2所示。圖中列表示不同揮發(fā)性物質，行表示雙孢蘑菇采后品質劣變的不同時期，顏色由綠色到紅色表示揮發(fā)性物質的含量由低到高，3個時期的揮發(fā)性物質的含量差異明顯，根據(jù)采后不同時期的聚類分析可知，第3天和第6天在最小距離水平首先發(fā)生聚類，說明第3天和第6天的揮發(fā)性物質的含量相似度較高，隨著歐氏距離的增加，0 d的才開始聚類在一起。在雙孢蘑菇采后品質劣變過程中，3-辛酮、苯甲醇、辛醇、苯甲醛、1-辛烯-3-醇的顏色較深，說明這幾種物質在雙孢蘑菇采后品質劣變過程中含量均高于其他物質。

a-揮發(fā)性物質種類變化；b-揮發(fā)性物質的總離子流圖
圖1 雙孢蘑菇采后衰老進程中揮發(fā)性物質種類變化和揮發(fā)性物質的總離子流圖
Fig.1 Changes of volatile substances in the postharvest aging process of A.bisporus and total ion current diagram of volatile substances

2.3 揮發(fā)性物質相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)分析

香氣主要取決于揮發(fā)性物質成分濃度的高低與閾值的大小，若只是以揮發(fā)性物質含量的高低定義該物質對香氣的貢獻是不準確的[12]，因此，本研究基于揮發(fā)性成分濃度的大小和閾值的高低對雙孢蘑菇采后品質劣變過程中的揮發(fā)性物質組分進行了ROAV分析，評分在0.1～1的物質對風味起修飾作用，而評分在1～100的物質是影響風味的關鍵性物質，結果如表2所示。雙孢蘑菇采后整個衰老過程中ROAV值在1～100的成分共有6種，在0.1～1的共有3種；在整個衰老過程中，(E)-2-庚烯醛、異戊醇、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-十一酮、1-辛烯-3-酮的ROAV評分均在1～100，因此可以說明這些物質是雙孢蘑菇采后品質劣變過程中的特征性風味物質；1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、3-辛酮，在雙孢蘑菇采后整個品質劣變過程中含量增加明顯(ROAV值在1～100)，因此，這幾種物質可以作為雙孢蘑菇采后品質劣變過程中風味物質劣變的關鍵性揮發(fā)性物質。

表1 雙孢蘑菇采后品質劣變過程中揮發(fā)性成分的GC-MS檢測結果
Table 1 GC-MS detection results of volatile components in the quality deterioration of A.bisporus during postharvest

注：RI表示質譜全離子掃描圖譜所得揮發(fā)性物質的保留指數(shù)；數(shù)據(jù)均為平均值±標準偏差；“/”表示未檢出；不同的小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)

圖2 雙孢蘑菇采后品質劣變過程中揮發(fā)性物質含量熱圖
Fig.2 Heat map of the content of volatile substances in the quality deterioration of A.bisporus during postharvest
注：熱圖中藍紫色表示風味物質含量為零；顏色由綠色向紅色表示風味物質含量由低到高的變化

表2 雙孢蘑菇采后品質劣變過程中關鍵揮發(fā)性風味物質確定
Table 2 Determination of key volatile flavor compounds in the process of postharvest quality deterioration of A.bisporus

注：“ND”表示無法查閱到閾值，故在ROAV的計算中不作分析的物質;“/”表示未查到相關描述

2.4 揮發(fā)性物質主成分分析

雙孢蘑菇在采后品質劣變過程中形成的香氣成分比較復雜，因此為了能更直觀地體現(xiàn)此過程中香氣物質間的差異，對不同時期的共有組分進行了主成分分析(圖3，表3)，以特征值為1進行因子抽提，得到PC1和PC2方差貢獻率分別為66.27%、33.73%，完全可以反映原始數(shù)據(jù)的可靠性。其中，PC1中載荷正向最大是B1(異戊醇)，PC1中載荷負向最大是A1[(E)-2-庚烯醛]，PC2中載荷正向最大是B5(正辛醇)，PC2中載荷負向最大是B2(2-十一酮)。以上結果說明醇類、醛醇和酮類物質對采后雙孢蘑菇品質劣變過程中的風味影響最大，其中，異戊醇、(E)-2-庚烯醛、正辛醇、2-十一酮是雙孢蘑菇采后品質劣變過程中含量變化最明顯的揮發(fā)性物質。因此，可以根據(jù)上述物質來判斷雙孢蘑菇采后品質的變化。

圖3 雙孢蘑菇關鍵揮發(fā)性風味物質主成分載荷圖
Fig.3 Load diagram of principal components of key volatile flavor substances of A.bisporus

表3 主成分特征值及方差貢獻率
Table 3 Principal component eigenvalues and variance contribution rates

2.5 雙孢蘑菇采后品質劣變過程中非揮發(fā)性物質含量的變化

2.5.1 游離氨基酸含量的變化

雙孢蘑菇中游離氨基酸是一類非常重要的滋味活性成分，根據(jù)氨基酸的呈味特性，可將其分為鮮味、甜味、苦味和無味四類，其含量的變化會直接影響雙孢蘑菇的鮮美程度。鮮味氨基酸和甜味氨基酸是蘑菇特殊風味的主要組分，而苦味氨基酸是不具有味覺活性的。隨著雙孢蘑菇子實體采后品質劣變程度的加深，檢測到雙孢蘑菇中21種游離氨基酸含量的變化，結果如表4所示。3個時期(0、3、6 d)游離氨基酸總量分別為51.65、57.30、54.89 μg/g，由此可知游離氨基酸含量隨雙孢蘑菇子實體品質的劣變呈現(xiàn)先增后減的趨勢。

2.5.2 呈味核苷酸含量的變化

雙孢蘑菇采后品質劣變過程中的5′-核苷酸含量變化如表5所示。由表5可知，5種5′-核苷酸的含量在采后品質劣變過程中呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，其中5′-CMP的含量最高，變化趨勢為先升高后降低，在采后第3天時其含量達到峰值，5′-UMP、5′-IMP、5′-AMP含量則是呈持續(xù)下降趨勢，5′-GMP變化趨勢為先增加后降低。YAMAGUCHI等[21]在食用菌中檢測到具有呈鮮貢獻的 5′-核苷酸，其中5′-GMP 具有肉香味，是一種風味增強劑。對于呈鮮味核苷酸(5′-GMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-AMP)總含量在0、3、6 d分別為29.05、22.16、13.10 μg/g。由此可見雙孢蘑菇在采后品質劣變過程中的鮮味變化隨采后時間的延長，鮮味逐漸降低。

表4 雙孢蘑菇采后品質劣變過程中游離氨基酸含量變化 單位：μg/g

Table 4 Changes of free amino acids in A.bisporus during the process of quality deterioration

注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準偏差;“/”表示未檢出，不同的小寫字母表示有顯著性差異(P< 0.05)(下同)

表5 雙孢蘑菇采后品質劣變過程中呈味核苷酸含量變化 單位：μg/g

Table 5 Changes in the content of flavored nucleotides during the quality deterioration of A.bisporus

2.5.3 有機酸含量的變化

食用菌中有機酸是構成其風味的主要成分之一，也是其他物質如氨基酸、揮發(fā)性物質等的合成基礎[22]。雙孢蘑菇采后品質劣變過程中有機酸含量變化趨勢為先升高后降低(表6)，在第3天時含量達到峰值(190.26 μg/g)。4種有機酸中，蘋果酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸的變化趨勢相同，均為先增加后降低，分別在采后第3天含量達到峰值，分別為 18.51、4.04、37.13、130.58 μg/g。

表6 雙孢蘑菇采后品質劣變過程中有機酸含量變化 單位：μg/g

Table 6 Changes of organic acid content during the quality deterioration of A.bisporus during postharvest

3 討論

食用菌的風味主要由揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分組成，揮發(fā)性風味物質如醛類、醇類、酮類、酯類物質等，對食用菌的風味形成有著重要的作用；非揮發(fā)性物質如游離氨基酸、呈味核苷酸、有機酸等，對食用菌滋味的形成至關重要[23]。本研究對雙孢蘑菇采后品質劣變過程中不同時間樣品的風味成分進行檢測分析。

采用SPME-GC-MS技術對雙孢蘑菇采后品質劣變過程中的揮發(fā)性風味物質進行檢測分析，共鑒定出38種揮發(fā)性風味物質，包括醛類9種、醇類13種、酮類9種、酯類6種、及呋喃類1種，其中醛類、酮類和醇類物質的變化最為明顯。在檢測到的醇類物質中，1-辛烯-3-醇的含量最高，這與前人的研究結果一致[12]。揮發(fā)性香氣成分是雙孢蘑菇采后品質劣變過程中品質變化的一個重要方面，通過對揮發(fā)性香氣的主成分分析得到醇類、醛醇和酮類物質對采后雙孢蘑菇品質劣變過程中的風味影響最大，其中，異戊醇、(E)-2-庚烯醛、正辛醇、2-十一酮是雙孢蘑菇采后品質劣變過程中含量變化最明顯的揮發(fā)性物質，因此以上述幾種風味物質的變化可為雙孢蘑菇采后品質的快速檢測、風味鑒定以及為貨架期的預測提供一定的理論依據(jù)。

通過對雙孢蘑菇采后品質劣變過程中的非揮發(fā)性風味物質進行檢測分析，結果表明游離氨基酸、呈味核苷酸、有機酸在采后品質劣變過程中均發(fā)生了顯著的變化。隨著雙孢蘑菇采后品質劣變的發(fā)生，游離氨基酸的含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，這與TSENG等[24]研究結果基本一致。在第3天時游離氨基酸含量上升可能是由于雙孢蘑菇采后呼吸速率加快，加速了蛋白質分解，使游離氨基酸不斷積累，隨后游離氨基酸含量緩慢下降，可能是由于采后其強烈的蒸騰作用使菌體失水過多，導致氨基酸合成和轉運受到抑制，為維持菌體正常生理活動加快了消耗以保證能量的供給[25]。在雙孢蘑菇采后品質劣變過程中呈味核苷酸含量呈緩慢下降的趨勢，這與LIU等[26]研究的不同保存方法對雙孢蘑菇在貯藏過程中呈味核苷酸含量的變化趨勢一致。雙孢蘑菇中主要的有機酸是檸檬酸和琥珀酸，其含量在采后品質劣變過程中呈先升后降的趨勢，雙孢蘑菇采后品質劣變過程中風味會隨之發(fā)生逐漸惡化，這是由于采后品質劣變過程中一些風味物質含量降低或者逐漸消失，有機酸和游離氨基酸等風味組分的代謝發(fā)生紊亂，最終導致雙孢蘑菇的風味品質發(fā)生改變[27-28]，雙孢蘑菇的風味物質逐漸變淡甚至喪失的同時，還會產生異味，這可能是由于原有風味物質已揮發(fā)或是后期無法合成，也有可能因采后品質劣變導致物質代謝異常從而產生異味物質[29-30]。

雙孢蘑菇的風味的形成是多方面因素共同作用的結果，雙孢蘑菇在生長過程中會積累大量次生代謝產物，如酚類、聚酮類等，在采后品質劣變過程中，貯藏的環(huán)境條件、腐敗微生物的生長都是影響雙孢蘑菇采后風味和品質變化的重要因素。因此，要明確雙孢蘑菇采后品質劣變過程中風味的變化機制，還需要進一步的研究。

4 結論

雙孢蘑菇采后品質劣變過程中各種揮發(fā)性風味物質的含量變化存在一定的差異。品質劣變初期雙孢蘑菇中揮發(fā)性物質主要以醇類為主，酮類、醛類、酯類次之，品質劣變后期醇類、酮類、醛類、酯類物質含量上升。醇類、醛類、酮類物質含量的升高對雙孢蘑菇揮發(fā)性風味的變化產生一定的不利影響。雙孢蘑菇采后品質劣變過程中非揮發(fā)性風味物質的變化規(guī)律因為具有相似性，游離氨基酸、有機酸的含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢；呈味核苷酸含量呈緩慢下降的趨勢。因此，可以依據(jù)采后品質劣變過程中風味物質的變化規(guī)律區(qū)分雙孢蘑菇樣品，研究結果為實現(xiàn)雙孢蘑菇品質的快速檢測、風味鑒定及貨架期的預測提供一定的理論依據(jù)。