重組限制性內(nèi)切酶Pst I發(fā)酵條件優(yōu)化

限制性內(nèi)切酶(簡稱為“限制酶”)是一大類能夠特異性識別與切割 DNA 分子內(nèi)特定序列的核酸內(nèi)切酶,被稱作“基因的剪刀”、“分子手術刀”等[1-4],被廣泛應用于DNA重組、基因定位與克隆、核酸疫苗制備等生物醫(yī)藥的各個領域[5-7]。

限制性內(nèi)切酶來源于原核生物的“限制-修飾”系統(tǒng),原始宿主自身的DNA被自身限制酶對應的甲基化酶修飾,從而避免被自身所產(chǎn)生的限制酶切割[8]。但常用的蛋白質工程菌宿主DNA不具備相應的甲基化修飾,直接重組表達限制酶會導致宿主因DNA被切割而死亡。因此,限制酶的大規(guī)模生產(chǎn)一直是世界性的難題,自20世紀70年代第一個限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品上市以來的40多年里,全球限制性內(nèi)切酶市場幾乎一直被美國NEB、美國Thermo Fisher、日本TaKaRa等幾家企業(yè)壟斷。

本實驗室在前期研究中,利用廣譜甲基化保護策略,實現(xiàn)了多種限制性內(nèi)切酶的重組表達[8-9],成果初步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,性能不亞于國外同類產(chǎn)品。但企業(yè)現(xiàn)有生產(chǎn)工藝仍停留在低密度搖瓶培養(yǎng)的階段,產(chǎn)量低,成本高,無法滿足行業(yè)需求。而將搖瓶發(fā)酵工藝參數(shù)直接移植到發(fā)酵罐之后,幾乎所有的限制酶均出現(xiàn)了產(chǎn)率下降的現(xiàn)象,少數(shù)種類甚至無法成功表達。因此,開發(fā)限制酶的高密度發(fā)酵工藝,是實現(xiàn)限制性內(nèi)切酶國產(chǎn)化的必經(jīng)之路。

限制性內(nèi)切酶Pst I是1976年從斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)中分離出來的一種II型限制性內(nèi)切酶,是最常用的30種限制酶之一[10]。本研究以Pst I為代表,使用大腸桿菌作為重組表達宿主,對影響菌體量與酶產(chǎn)率的發(fā)酵條件進行了篩選,優(yōu)化了Pst I的重組表達發(fā)酵條件,同時也為實現(xiàn)其他限制性內(nèi)切酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Pst I大腸桿菌重組表達菌株,本實驗室自行制備保存；商品lightingTMPst I酶、CutOneTM反應緩沖液、無縫克隆試劑盒,江蘇愚公生命科技有限公司；Ni 親和層析基質(Toyopearl AF),東曹(上海)生物科技有限公司；HiTrap Heparin親和層析柱,美國GE公司；Lambda DNA與B-PER細胞裂解液,美國Thermo Fisher Scientific公司；其他未注明試劑均為分析純,中國國藥控股有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫金屬浴,杭州米歐儀器有限公司；恒溫震蕩搖床,上海一恒科技有限公司；GenoSens1860凝膠成像系統(tǒng),上海勤翔科學儀器有限公司；JN-02細胞高壓破碎儀,廣州聚能生物科技有限公司；Avanti J-26 s XP 高速冷凍離心機,美國Beckman公司；高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司；Synteny Neo2多功能酶標儀,美國Bio Tek公司；T100梯度PCR儀,美國Bio-Rad公司；六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐(1 L×6),上海百侖生物科技有限公司；NanoDrop Lite 分光光度計,美國Thermo Scientific公司。

1.3 Pst I 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1 優(yōu)化發(fā)酵溫度

取本實驗室保藏的Pst I大腸桿菌重組表達菌株在含有0.1 g/L卡那霉素和0.15 g/L氯霉素的LB平板培養(yǎng)基上劃線,37 ℃培養(yǎng)活化。挑取陽性單克隆,測序驗證后接種于10 ml LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng),獲得發(fā)酵種子液。然后以5%(體積分數(shù),下同)的接種量接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐中400 r/min進行發(fā)酵。當發(fā)酵液OD600到達0.8時,使用終濃度0.5 mmol/L 的IPTG進行誘導,分別設置發(fā)酵溫度為37、30、23與16 ℃,發(fā)酵12 h。

1.3.2 優(yōu)化誘導后發(fā)酵時間

將種子液以5%的接種量接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵。當發(fā)酵液OD600到達0.8時,使用終濃度0.5 mmol/L 的IPTG進行誘導,同時分別設置誘導后發(fā)酵時間為2、4、6、8、10、12、14、16與18 h。

1.3.3 優(yōu)化誘導劑濃度

將種子液以5%的接種量接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵。當發(fā)酵液OD600到達0.8時,使用終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8與2.0 mmol/L的IPTG進行誘導。

1.3.4 優(yōu)化補充碳源

將種子液以5%的接種量接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,同時分別添加10 g/L的葡萄糖、甘油、蔗糖與麥芽糖作為補充碳源,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵。當發(fā)酵液OD600到達0.8時,使用IPTG進行誘導。

1.3.5 優(yōu)化pH值

將種子液以5%的接種量分別接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中,于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐進行發(fā)酵。在發(fā)酵開始前使用10%氨水 與10%磷酸(均為體積分數(shù),下同)分別調(diào)整發(fā)酵體系pH值為5.0、6.0、7.0、8.0與9.0(±0.2)。當發(fā)酵液OD600到達0.8時,使用IPTG進行誘導。

1.3.6 優(yōu)化誘導時機

將種子液以5%的接種量分別接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐進行發(fā)酵。然后于每2 h測定發(fā)酵液OD600,繪制菌體生長曲線。

將種子液以5%的接種量分別接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中于六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐進行發(fā)酵。在發(fā)酵開始時使用10%氨水與10%磷酸調(diào)整發(fā)酵體系pH值,當發(fā)酵進行到2、4、6與8 h時使用IPTG進行誘導。

1.4 Pst I 酶活力檢測

本研究中Pst I酶活力采用如下定義：37 ℃下,在10 μl反應體系中,能夠在15 min內(nèi)完全消化1 μg Lambda DNA所需的酶量定義為1 U。發(fā)酵結束后取1 ml發(fā)酵液5 500 r/min,5 min離心分離菌體與上清液。將菌體控干水分置于-20 ℃下,加入100 μl B-PER細胞裂解液裂解菌體4 ℃,13 000×g,20 min離心獲得粗酶液。取20 μl粗酶液,以2倍梯度稀釋。酶活力測試反應體系為10 μl,包括1 μl稀釋酶液,1 μg Lambda DNA以及1 μl 10× CutOne緩沖液,將其置于恒溫金屬浴中37 ℃ 孵育15 min,然后將其移至已預熱至80 ℃的恒溫金屬浴中失活20 min,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。第1個無法完全消化Lambda DNA底物的稀釋梯度所對應的上一級稀釋液酶濃度即為1 U/μl。

1.5 Pst I 蛋白純化

將種子液以5%的接種量分別接種于含有0.1 g/L卡那霉素與0.15 g/L氯霉素的2YT液體培養(yǎng)基中于發(fā)酵罐進行發(fā)酵。在發(fā)酵開始時使用10%氨水與10%磷酸調(diào)整發(fā)酵體系pH值,使用IPTG進行誘導,待發(fā)酵結束后,破碎細胞并依次使用Ni親和層析柱與肝素親和層析柱對Pst I蛋白進行純化,使用SDS-PAGE檢測純化后蛋白,同時使用NanoDrop Lite 分光光度計對蛋白濃度進行測定。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 優(yōu)化發(fā)酵溫度

溫度是影響菌體生長代謝、重組產(chǎn)物形成與質粒穩(wěn)定性的重要因素。大腸桿菌最適生長溫度為37 ℃,最高生長溫度為41.6 ℃,最低生長溫度為8.46 ℃[11],因此為獲得高水平Pst I蛋白表達,需對發(fā)酵溫度進行優(yōu)化。隨著誘導溫度增加,酶產(chǎn)率呈不斷增加趨勢；當發(fā)酵溫度為37 ℃時,酶產(chǎn)率菌體量最高(圖1)。可能是因為37 ℃ 時菌體生長速度、蛋白的表達速度與相關酶活性高,有利于Pst I蛋白積累。

圖1 發(fā)酵溫度對菌體生長及酶產(chǎn)率的影響

Fig.1 Effect of culture temperatures on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.2 優(yōu)化誘導后發(fā)酵時間

誘導后發(fā)酵時間是影響外源基因重組表達的重要因素[12],尤其對于限制性內(nèi)切酶而言,發(fā)酵時間過短則蛋白表達量不夠,發(fā)酵時間過長則有可能積累細胞毒性導致宿主細胞死亡。如圖2所示,隨誘導后發(fā)酵時間的增加,Pst I酶產(chǎn)率表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,同時菌體量隨發(fā)酵時間的增加而不斷增加,因此Pst I菌株最佳誘導后發(fā)酵時間為8 h時。

圖2 誘導后發(fā)酵時間對菌體生長及酶產(chǎn)率的影響

Fig.2 Effect of post-induction fermentation times on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.3 優(yōu)化IPTG誘導濃度

本研究所使用的重組表達載體是在pET28b基礎上構建的,具有乳糖操縱子調(diào)控的啟動子,可使用乳糖類似物IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)進行誘導表達[13]。但IPTG具有潛在毒性,過量添加對菌體生長具有一定的抑制作用[14]。隨著IPTG濃度增加,Pst I酶產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(圖3-a),同時菌體量隨IPTG誘導濃度的增加而呈現(xiàn)不斷降低(圖3-b),因此Pst I菌株最佳IPTG誘導濃度為1.4 mmol/L。

a-菌體濃度;b-酶產(chǎn)率

圖3 IPTG誘導劑濃度對菌體生長及酶產(chǎn)率的影響

Fig.3 Effect of IPTG concentrations on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.4 優(yōu)化補充碳源

在高密度發(fā)酵中,通常需要添加額外碳源,以滿足大腸桿菌高密度發(fā)酵的要求[15]。大腸桿菌高密度發(fā)酵中常用碳源有葡萄糖、甘油、蔗糖與麥芽糖[16]。由圖4可知在甘油、葡萄糖、麥芽糖與蔗糖中,使用甘油作為額外碳源酶Pst I酶產(chǎn)率與菌體量最高,考慮到使用甘油作為補充碳源,可以減少發(fā)酵過程中乙酸積累,有利于菌體的生長。因此Pst I菌株最適補充碳源為甘油。

圖4 碳源對菌體生長及酶產(chǎn)率的影響

Fig.4 Effect of carbon sources on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.5 優(yōu)化pH值

pH作為影響發(fā)酵的關鍵因素之一,其對高密度發(fā)酵中的菌體量與酶產(chǎn)率具有較大影響[17-18]。大腸桿菌生長pH范圍為5.35～9.72,最適宜pH為7.79[19]。由圖5可知,菌體量在pH 5.0～9.0呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,pH 5.0～8.0菌體量持續(xù)增加,pH在8.0～9.0,菌體量開始降低。Pst I酶產(chǎn)率隨pH的改變也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在pH 8.0時為最高酶產(chǎn)率。使用Expasy在線工具對Pst I蛋白的等電點進行計算[20],可知Pst I蛋白的等電點為8.34。同時由大腸桿菌的最適pH為7.79和本次實驗結果,推測Pst I菌株最適發(fā)酵pH為8.0。

圖5 pH值對菌體生長及酶產(chǎn)率的影響

Fig.5 Effect of pH on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.1.6 優(yōu)化誘導時機

對Pst I重組表達菌株進行生長曲線測定可以確定菌株生長情況,從而為優(yōu)化誘導時機提供依據(jù)。由Pst I菌體生長曲線可知(圖6-a),0～3 h為菌體生長延滯期,3～15 h為菌體生長對數(shù)期,15 h之后進入平臺期。添加誘導劑的時間一般為為菌體的對數(shù)生長期的前期或者中期[21]。為了篩選得到合適的誘導時機,根據(jù)菌體生長曲線與課題組已有相關實驗,在發(fā)酵進行到2、4、6與8 h時分別添加終濃度1.4 mmol/L的IPTG,進行最佳誘導時機篩選實驗。

結果表明(圖6-b),菌體量在誘導時機2～8 h內(nèi)呈現(xiàn)波動趨勢,同時Pst I酶產(chǎn)率也隨誘導時機的不斷增加而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。誘導時機為6 h時獲得最高菌體量與酶產(chǎn)率,同時由生長曲線可知6 h位于菌體生長的對數(shù)生長中期,菌體生長旺盛,更適合目標蛋白的積累。因此Pst I菌株最適誘導時機為6 h。本研究采用GpC廣譜甲基化修飾保護的策略來重組表達限制酶,會引起基因組的大范圍過度甲基化,而甲基化會抑制大多數(shù)基因轉錄,從而導致細胞生長受到影響。因此在Pst I等限制酶重組表達過程中,發(fā)酵菌液的OD600明顯低于普通大腸桿菌發(fā)酵[22]。

a-菌體濃度；b-酶產(chǎn)率

圖6 誘導時機對菌體生長及酶產(chǎn)率的影響

Fig.6 Effect of induction times on the growth of engineering bacteria and Pst I production

2.2 Pst I 蛋白純化與酶活力分析

使用優(yōu)化的發(fā)酵方案：控制發(fā)酵體系pH 8.0,溫度37 ℃,當發(fā)酵進行到6 h時,補加終濃度1.4 mmol/L IPTG進行誘導,誘導后發(fā)酵時長為8 h。發(fā)酵結束后離心收集菌體,破碎細胞后依次使用Ni親和層析柱與肝素親和層析柱進行純化,并用SDS-PAGE分析。由圖7可知蛋白條帶清晰明顯,條帶對應分子量符合目的蛋白(40.7 kDa)。經(jīng)NanoDrop Lite 分光光度計測定蛋白濃度,換算得到優(yōu)化后的Pst I蛋白產(chǎn)率為0.0129 g/L,酶產(chǎn)率為1.926×106 U/L。

a-Pst I Ni柱純化結果，M-marker，1-5分別為使用不同濃度咪唑的洗脫液，6-含有目的蛋白的洗脫液，7-標注的蛋白條帶；b-Pst I 肝素柱純化結果，M-marker，1和2為使用肝素純化后的目的蛋白，3-標注的蛋白條帶

圖7 SDS-PAGE分析重組Pst I蛋白純化結果

Fig.7 SDS-PAGE of purified recombinant Pst I protein

而相關企業(yè)使用優(yōu)化前的條件,在發(fā)酵罐中所獲得的蛋白產(chǎn)率僅為0.006 g/L,酶產(chǎn)率僅為5.14×105 U/L?？梢姲l(fā)酵工藝經(jīng)過優(yōu)化后,Pst I的蛋白產(chǎn)率提高到2.15倍,酶產(chǎn)率提高到3.74倍(圖8)。

圖8 優(yōu)化前與優(yōu)化后蛋白產(chǎn)率與酶產(chǎn)率比較

Fig.8 Protein yield and active enzyme yield before and after optimization

3 結論

本研究以實驗室前期通過廣譜甲基化保護,初步實現(xiàn)了部分限制性內(nèi)切酶的國產(chǎn)化生產(chǎn)的前提下,以限制性內(nèi)切酶Pst I為對象,進行了高密度發(fā)酵工藝的初步探索。通過單因素試驗篩選了誘導溫度、誘導時間、誘導劑濃度、補充碳源、pH值與誘導時機等多個發(fā)酵條件。結果表明,在37 ℃下,開始發(fā)酵后6 h,添加終濃度1.4 mmol/L IPTG進行誘導發(fā)酵8 h,以甘油為補充碳源,控制發(fā)酵體系pH為8.0。在此發(fā)酵條件下Pst I蛋白產(chǎn)量為0.0129 g/L,為未優(yōu)化的2.15倍,同時酶產(chǎn)率為1.926×106 U/L,為未優(yōu)化的3.74倍。后續(xù)還需要進一步優(yōu)化條件,繼續(xù)提升菌體濃度和酶產(chǎn)率,以實現(xiàn)高密度發(fā)酵。本研究建立的發(fā)酵工藝已被用于Pst I的商業(yè)化生產(chǎn),并可以為其他限制性內(nèi)切酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考依據(jù)。