牡蠣精氨酸激酶過(guò)敏原小鼠過(guò)敏模型的建立與分析

在主要的過(guò)敏食物中,貝類(lèi)、魚(yú)、花生和堅(jiān)果更有可能引發(fā)危及生命的全身過(guò)敏反應(yīng)[1]。貝類(lèi)過(guò)敏在西方國(guó)家中很常見(jiàn),且逐漸在亞洲部分地區(qū)的兒童和成人中變得普遍[2]。目前已發(fā)現(xiàn)6種貝類(lèi)過(guò)敏原,包括原肌球蛋白、肌漿鈣結(jié)合蛋白、精氨酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、肌漿蛋白輕鏈和肌鈣蛋白[3-7]。抗原首次進(jìn)入機(jī)體后會(huì)誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)抗體,IgE與肥大細(xì)胞表面的FcεR I受體結(jié)合,使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次暴露于相同抗原時(shí),致敏細(xì)胞上的IgE會(huì)與其結(jié)合并導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺、類(lèi)花生酸、蛋白酶和其他趨化和促炎細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì),這些介質(zhì)會(huì)募集白細(xì)胞,同時(shí)引起平滑肌收縮、血管擴(kuò)張、黏液高分泌和血管通透性增加等生理病理學(xué)變化,這也是過(guò)敏癥狀的發(fā)病機(jī)制[8-9]。有證據(jù)表明,牡蠣的攝入、皮膚和黏膜接觸以及霧化牡蠣蛋白的吸入可導(dǎo)致患者出現(xiàn)多種臨床癥狀[10-12],而牡蠣中的精氨酸激酶(arginine kinase,AK)也被驗(yàn)證為過(guò)敏原。

過(guò)敏原致敏性可以通過(guò)比較序列同源性、IgE結(jié)合、血清檢測(cè)、消化率和穩(wěn)定性來(lái)評(píng)估,目前蝦、蟹等過(guò)敏原的研究主要集中在這些方向,但合適的動(dòng)物模型能更直接地確定蛋白質(zhì)的過(guò)敏反應(yīng)[13],但至今未見(jiàn)牡蠣AK動(dòng)物致敏模型的相關(guān)報(bào)道。過(guò)敏食物評(píng)價(jià)的常用動(dòng)物模型有BALB/c小鼠、棕色挪威大鼠、豚鼠等,BALB/c小鼠體積小,繁殖周期短,過(guò)敏原刺激后偏向Th2型細(xì)胞應(yīng)答且可以產(chǎn)生高效價(jià)的IgE,所以選擇該品系小鼠為IgE介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的研究對(duì)象[14-15]。小鼠的給藥途徑包括口服灌胃、腹腔注射和表皮致敏,口服灌胃能更好地模擬人體經(jīng)口攝入食物過(guò)敏原的實(shí)際情況,不過(guò)容易誘導(dǎo)免疫耐受。研究發(fā)現(xiàn)霍亂毒素會(huì)使IL-4、IL-5顯著上升,而IL-2、IFN-γ基本無(wú)變化,并且能選擇性發(fā)生以Th2為主的過(guò)敏反應(yīng),所以將它作為黏膜佐劑可有效克服耐受現(xiàn)象[16]。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)利用提取純化的牡蠣AK和無(wú)毒的霍亂毒素B亞基(cholera toxin B subunit,CTB)致敏雌性BALB/c小鼠,通過(guò)觀(guān)察BALB/c小鼠的全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)及體重,測(cè)定其血清中總IgE(tIgE)、特異性IgE(sIgE)水平和血漿中血項(xiàng)含量的變化,對(duì)空腸、肝臟、脾臟和腎臟進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后觀(guān)察病理變化,對(duì)空腸進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色來(lái)觀(guān)察肥大細(xì)胞脫顆粒情況,初步建立牡蠣AK BALB/c小鼠過(guò)敏模型,為理解貝類(lèi)過(guò)敏的有關(guān)免疫機(jī)制和研發(fā)預(yù)防及治療食物過(guò)敏的藥物及治療策略提供有價(jià)值的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性BALB/c小鼠,6周齡,30只,維通利華動(dòng)物公司,許可證號(hào)為SYXK(京)2017-0033；牡蠣AK經(jīng)過(guò)提取純化獲得；小鼠IgE酶聯(lián)免疫試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgE、抗凝劑EDTA-K2、TMB顯色液、重組霍亂毒素B亞基,碧云天公司。以下所有實(shí)驗(yàn)得到中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2019—0002)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BALB/c小鼠的致敏

雌性BALB/c小鼠適應(yīng)1周后將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(20只)和PBS對(duì)照組(10只),致敏前取血作為陰性血清。使用口服灌胃與腹腔注射牡蠣AK兩種方式對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行致敏(如圖1)：在第0、8、16、24、32、40天,實(shí)驗(yàn)組每只灌胃含有10 μg CTB及600 μg AK的200 μL PBS進(jìn)行致敏；在第4、12、20、28、36天腹腔注射200 μL相同劑量的AK和CTB。在第45天用6 mg/mL的AK(200 μL)分別進(jìn)行灌胃和腹腔注射激發(fā)。對(duì)照組灌胃等體積PBS(pH 7.4),步驟相同。分別于第16、28、36、40、45天內(nèi)取血,離心收集血清,用于檢測(cè)tIgE、sIgE；同時(shí)于第16、36、45天取血于7.5% EDTA-K2抗凝管中,離心收集血漿并冷凍于-80 ℃,用于測(cè)定血項(xiàng)水平的變化。

圖1 BALB/c小鼠的致敏流程

Fig.1 Sensitization procedure of BALB/c mice

1.2.2 BALB/c小鼠的全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)評(píng)估

在第45天通過(guò)灌胃和腹腔注射高濃度牡蠣AK進(jìn)行激發(fā),激發(fā)后20～60 min進(jìn)行體溫測(cè)量,仔細(xì)察看小鼠全身過(guò)敏反應(yīng)現(xiàn)象,同時(shí)根據(jù)過(guò)敏評(píng)分表(表1)確定其表型過(guò)敏級(jí)數(shù)[17-18]。

表1 過(guò)敏反應(yīng)級(jí)數(shù)

Table 1 Allergy reaction grade

平均過(guò)敏級(jí)數(shù)達(dá)到2級(jí)即確定發(fā)生表型過(guò)敏反應(yīng)。平均反應(yīng)級(jí)數(shù)和過(guò)敏率按公式(1)(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：平均過(guò)敏級(jí)數(shù)；Ad,過(guò)敏級(jí)數(shù)；RA,過(guò)敏率,%；n,過(guò)敏動(dòng)物數(shù)量；N,總動(dòng)物數(shù)量。

1.2.3 BALB/c小鼠體重和血項(xiàng)指標(biāo)變化

致敏期間每2周稱(chēng)體重,計(jì)算平均體重。第16、36、45天分別取血于含有抗凝劑EDTA-K2的抗凝管中,使用血細(xì)胞分析儀對(duì)血漿中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞這3種血項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 tIgE、sIgE水平的檢測(cè)

利用間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)量BALB/c小鼠血清中sIgE,用質(zhì)量濃度為50 μg/mL的牡蠣AK包被96孔板,4 ℃孵育過(guò)夜；添加300 μL/孔的5%脫脂奶粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)37 ℃封閉1 h；再取100 μL 2%脫脂奶粉稀釋的BALB/c小鼠血清(1∶5)加入孔中,室溫下孵育3 h；每孔添加100 μL HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgE(1∶2 000),37 ℃孵育1 h；用200 μL TMB避光孵育20 min,然后添加50 μL 2 mol/L的H2SO4溶液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀于450 nm測(cè)量OD值。每?jī)刹街g都用PBST洗滌4次,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。使用ELISA試劑盒對(duì)BALB/c小鼠血清tIgE水平進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 BALB/c小鼠臟器、腸道病理學(xué)分析

第45天激發(fā)采血后,處死小鼠,取其空腸、肝臟、脾臟、腎臟,放入10%的多聚甲醛固定后修剪；用不同濃度梯度的乙醇進(jìn)行脫水處理,石蠟包埋后切片并進(jìn)行HE染色,用顯微鏡觀(guān)察組織形態(tài)；空腸甲苯胺藍(lán)染色后觀(guān)察其肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS及OriginPro 8.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),組間檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn),P<0.01差異極顯著(用**表示)；P<0.05差異顯著(用*表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BALB/c小鼠的全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)結(jié)果

第45天口服激發(fā)30 min后,實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出0～4級(jí)過(guò)敏癥狀(圖2),其中有7只BALB/c小鼠不斷對(duì)鼻子、耳朵、頭周?chē)案共窟M(jìn)行抓撓,有5只眼或口周?chē)霈F(xiàn)浮腫且毛發(fā)豎立；4只經(jīng)常喘息、側(cè)臥,有3只對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍并伴有顫抖癥狀,僅有1只無(wú)明顯癥狀；對(duì)照組BALB/c小鼠均未出現(xiàn)過(guò)敏癥狀。盡管小鼠在不同過(guò)敏級(jí)別的數(shù)量上存在一些差異,但表明通過(guò)灌胃和腹腔注射AK的BALB/c小鼠從表型來(lái)看發(fā)生了過(guò)敏反應(yīng),且過(guò)敏率為95%。

圖2 BALB/c小鼠的過(guò)敏反應(yīng)級(jí)數(shù)

Fig.2 Allergic reaction level of BALB/c mice

2.2 BALB/c小鼠體重和血項(xiàng)指標(biāo)變化

2.2.1 BALB/c小鼠體重變化

體重變化情況如圖3所示,所有BALB/c小鼠體重均逐漸增長(zhǎng),但與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組體重增加緩慢。在0～14 d內(nèi)差異不明顯,之后實(shí)驗(yàn)組小鼠體重明比對(duì)照組輕,第42天兩者平均體重差約0.5 g。這可能是因?yàn)檫^(guò)敏反應(yīng)使其消化吸收系統(tǒng)功能紊亂,影響了小鼠的健康狀態(tài),所以體重增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩。

圖3 BALB/c小鼠體重變化

Fig.3 Body weight changes of BALB/c mice

2.2.2 BALB/c小鼠血項(xiàng)指標(biāo)變化情況

當(dāng)同種過(guò)敏原再次進(jìn)入處于致敏狀態(tài)的機(jī)體時(shí),機(jī)體內(nèi)細(xì)胞會(huì)隨之產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng),從而引起白細(xì)胞數(shù)目及分類(lèi)的變化。白細(xì)胞是不均一的細(xì)胞群,按照其形態(tài)、功能和來(lái)源部位分為：粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,粒細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞(桿狀核及分葉核)、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞,不同類(lèi)型的白細(xì)胞以不同形式在機(jī)體中發(fā)揮防衛(wèi)作用[19]。從表2可知,隨著致敏時(shí)間的增加,實(shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞數(shù)量也逐漸增加,而對(duì)照組基本無(wú)變化,在第36、45天呈現(xiàn)出顯著性升高,這說(shuō)明BALB/c小鼠在免疫期間一直處于過(guò)敏狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞在第45天呈現(xiàn)出顯著差異,嗜酸性粒細(xì)胞在第36天開(kāi)始呈現(xiàn)出極顯著差異,這兩種粒細(xì)胞數(shù)量整體呈增加趨勢(shì)。嗜酸性粒細(xì)胞在過(guò)敏反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用,該細(xì)胞會(huì)釋放有毒的顆粒蛋白和脂質(zhì)介質(zhì),引起組織損傷和功能障礙,加劇炎癥反應(yīng),但也能吞噬抗原抗體復(fù)合物[20]。這3種血項(xiàng)指標(biāo)的變化也進(jìn)一步說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠對(duì)AK產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。

表2 BALB/c小鼠血項(xiàng)指標(biāo)變化

Table 2 Changes in blood index of BALB/c mice

2.3 血清中tIgE、sIgE的含量變化

2.3.1 血清中tIgE的含量

I型過(guò)敏機(jī)制由IgE介導(dǎo),如圖4所示,隨著免疫時(shí)間的增加,實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)tIgE水平也不斷升高,對(duì)照組基本維持在11 μg/mL左右。與對(duì)照組相比,第28天實(shí)驗(yàn)組的tIgE含量開(kāi)始明顯增加,之后呈上升趨勢(shì),到第45天激發(fā)后實(shí)驗(yàn)組血清中tIgE水平達(dá)到41.06 μg/mL,幾乎是對(duì)照組的4倍。此外,與第16天比較后,實(shí)驗(yàn)組第45天tIgE含量表現(xiàn)出極顯著的升高。免疫期間實(shí)驗(yàn)組tIgE不斷增加,對(duì)照組不變,證明實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠處于較嚴(yán)重的過(guò)敏狀態(tài)。

圖4 BALB/c小鼠血清總IgE含量

Fig.4 Total serum IgE content in BALB/c mice

2.3.2 血清中sIgE水平測(cè)定

血清中sIgE含量是評(píng)價(jià)過(guò)敏原致敏性的重要檢測(cè)指標(biāo)。圖5顯示的是BALB/c小鼠在不同階段的血清sIgE水平變化情況,通過(guò)對(duì)血清sIgE抗體的檢測(cè),能夠確定引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原種類(lèi)和致敏效果。從第16天到第45天,實(shí)驗(yàn)組sIgE抗體含量逐漸升高,且明顯高于正常值。在激發(fā)實(shí)驗(yàn)后,與對(duì)照組sIgE含量相比有顯著提高。因此,BALB/c小鼠的過(guò)敏反應(yīng)是由牡蠣AK引起的。

圖5 BALB/c小鼠的sIgE變化

Fig.5 sIgE changes in BALB/c mice

將牡蠣過(guò)敏患者血清與BALB/c小鼠致敏血清的sIgE含量相比(圖6),發(fā)現(xiàn)患者、小鼠的致敏血清與對(duì)照組對(duì)比后都出現(xiàn)極顯著增加,但患者和鼠的過(guò)敏血清無(wú)顯著性差異,從而成功獲得其種屬特異性AK致敏血清。

RC-對(duì)照組BALB/c小鼠血清；R-實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠血清；HC-正常人血清；H-對(duì)牡蠣過(guò)敏的人血清

圖6 人和BALB/c小鼠的sIgE比較

Fig.6 Comparison of sIgE between human and BALB/c mice

2.4 組織病理學(xué)染色分析

空腸、脾臟、肝臟、腎臟的組織切片如圖7所示,對(duì)照組小鼠各臟器組織結(jié)構(gòu)正常,基本無(wú)明顯病理改變(圖7-a1～圖7-d1)。實(shí)驗(yàn)組肝臟中央靜脈和肝竇都明顯擴(kuò)張充血,一些肝細(xì)胞索斷開(kāi)、收縮且使血液相互融合從而產(chǎn)生淤血帶(圖7-a2)。實(shí)驗(yàn)組腸絨毛上皮脫落、紊亂,腸黏膜間質(zhì)中炎細(xì)胞局部浸潤(rùn),血管充血水腫,組織疏松(圖7-b2)。有研究發(fā)現(xiàn),在鼠灌胃致敏模擬食物過(guò)敏中,其腸道產(chǎn)生過(guò)敏癥狀,慢性炎癥導(dǎo)致屏障功能的調(diào)節(jié)和上皮滲透性的增加,小腸組織造成損傷,從而使腸道攝取更多的免疫完整的大分子[21]。實(shí)驗(yàn)組脾臟紅髓部分充血,邊緣竇有許多淋巴灶(圖7-c2)。模型組腎臟患腎小球炎,血管球成分葉狀,基底膜稍有增厚,炎癥細(xì)胞增加(圖7-d2)。這也許是因?yàn)檫^(guò)敏反應(yīng)產(chǎn)生許多嗜酸性粒細(xì)胞,進(jìn)入腎臟后使BALB/c小鼠的器官發(fā)生病變。

a-肝臟HE染色；b-空腸HE染色；c-脾臟HE染色；d-腎臟HE染色；e-空腸甲苯胺藍(lán)染色；1-對(duì)照組；2-實(shí)驗(yàn)組

圖7 器官HE與甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

Fig.7 Results of organ HE and toluidine blue staining

空腸組織經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后如圖7-e所示,肥大細(xì)胞顆粒呈藍(lán)紫色,胞核為藍(lán)色。對(duì)照組的小鼠腸道(圖7-e1)固有層肥大細(xì)胞較少、胞膜完整、輪廓清晰,只有很小一部分脫顆粒,而模型組的腸(圖7-e2)固有層肥大細(xì)胞增加,很多肥大細(xì)胞脫顆粒后胞膜破損、輪廓模糊。肥大細(xì)胞是I型過(guò)敏反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞,IgE由B細(xì)胞受抗原刺激后分泌,肥大細(xì)胞表面的FcεR I受體能夠結(jié)合IgE的Fc片段,當(dāng)抗原再次入侵時(shí),IgE的Fab片段識(shí)別和結(jié)合抗原,抗原、IgE和FcεR I之間的交聯(lián)導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放顆粒[22-23]。所以肥大細(xì)胞脫顆粒是過(guò)敏反應(yīng)研究的主要階段,其數(shù)量及脫顆粒情況能夠良好的反映組織過(guò)敏情況。病理觀(guān)察表明實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠空腸已產(chǎn)生明顯的過(guò)敏現(xiàn)象。

3 結(jié)論

由于經(jīng)濟(jì)全球化和人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)的改變,牡蠣引起的過(guò)敏性疾病發(fā)病率正逐漸增加,這對(duì)人們的身體健康和生活質(zhì)量形成了極大的威脅。本研究利用天然牡蠣AK通過(guò)經(jīng)口灌胃與腹腔注射結(jié)合并添加CTB佐劑的方式致敏BALB/c小鼠,同時(shí)從表型過(guò)敏級(jí)數(shù)、體重方面證明實(shí)驗(yàn)組小鼠已產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),而且也許因?yàn)檫^(guò)敏反應(yīng)使臟器受到損傷影響了小鼠的消化吸收,導(dǎo)致部分體重比對(duì)照組低,實(shí)驗(yàn)組血項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。另外,免疫期間模型組tIgE和sIgE水平也顯著增多,組織病理學(xué)分析結(jié)果說(shuō)明模型組臟器均出現(xiàn)組織損傷,空腸肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)成功建立并分析了牡蠣AK小鼠致敏模型,獲得了AK動(dòng)物致敏血清,并從整體動(dòng)物水平和形態(tài)學(xué)角度證明了牡蠣AK的致敏性。通過(guò)AK建立BALB/c小鼠致敏模型對(duì)研究食物過(guò)敏的致敏機(jī)制及臨床上預(yù)防及治療食物過(guò)敏具有重要的理論意義。接下來(lái)將建立細(xì)胞模型并對(duì)Th2型淋巴細(xì)胞水平及其相關(guān)細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度和通路進(jìn)行詳細(xì)研究。