E.coliDH10B堿性磷酸酶基因的克隆、表達(dá)及活性研究-醫(yī)學(xué)論文

堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）是一類非特異性磷酸單酯酶，可催化磷酸單酯的水解[1]。AKP廣泛存在于多種細(xì)菌、真菌和動(dòng)物中。不同來(lái)源的AKP的相對(duì)分子質(zhì)量和編碼序列差異很大，且各種AKP的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)制也不完全相同。其中，E.coliAKP由phoA基因編碼，為同源二聚體金屬酶，單體由449個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為47K，活性中心包括3個(gè)金屬原子，即2個(gè)鋅原子和1個(gè)鎂原子[2]。

　　E.coliAKP催化機(jī)制明確，底物范圍廣泛，作為工具酶在表位連鎖、組織化學(xué)、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應(yīng)用。E.coliDH10B無(wú)致病性和耐藥基因，是基因克隆的常用受體菌。本研究首次從E.coliDH10B基因組中克隆了AKP的成熟肽基因（phoAm）并進(jìn)行了表達(dá)研究，從而為此種酶的結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1菌株、載體大腸桿菌菌株E.coliDH10B、E.coliBL21（DE3）、E.coliDH5α及原核表達(dá)載體pET28a（+）由熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

　　1.1.2試劑T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、對(duì)硝基苯磷酸（pNPP）購(gòu)自生工生物（上海）有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、PfuDNA聚合酶購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、重組標(biāo)簽蛋白快速檢測(cè)試劑盒GoldCassette-HIS購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

　　1.1.3引物引物設(shè)計(jì)后由生工生物（上海）有限公司合成。

　　1.1.4儀器UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津）；超微量黑色石英比色皿（島津）；PCR擴(kuò)增儀（2720ThermalCyclerAppliedBiosystems）；凝膠成像系統(tǒng)（BioRad）。

　　1.2方法

　　1.2.1E.coliDH10B基因組DNA的提取與純化E.coliDH10B甘油菌經(jīng)LB培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)后，用天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取與純化。提取的基因組DNA用紫外分光光度法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

　　1.2.2引物設(shè)計(jì)從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)下載E.coliDH10B的phoA基因序列（accessionnumber：NC-010473），使用PrimerPremier6.0和Oligo7.37輔助設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增AKPphoAm的引物，為便于克隆進(jìn)表達(dá)載體pET28a中，在引物兩端加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)和保護(hù)堿基。設(shè)計(jì)的引物如下，正向引物（phoAm-F）：5'-GTCATGGATCCCGGACACCAGAAATGCC-3'（BamHⅠ）；反向引物（phoAm-R）：5'-GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC-3'（HindⅢ）。

　　1.2.3PCR法擴(kuò)增phoA基因在0.2mlPCR管內(nèi)配制50μl反應(yīng)體系，按下述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性3min；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，即94℃30s→55℃30s→72℃2min；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并進(jìn)行測(cè)序。

　　1.2.4phoAm基因的克隆PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，并與同樣經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的表達(dá)載體pET28a（+）經(jīng)T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB/kan篩選平板培養(yǎng)后，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.2.5phoAm基因的誘導(dǎo)表達(dá)分別接種pET28a-phoAm/BL21（DE3）和pET28a/BL21（DE3）單菌落至5mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%的比例接種陽(yáng)性菌液至100mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600nm約為0.4時(shí)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)3h。

　　1.2.6重組蛋白（rAKP）的檢測(cè)菌體離心后，加入緩沖液超聲破碎，離心取上清液，用免疫金層析法檢測(cè)6×His標(biāo)簽，用SDS-PAGE法檢測(cè)表達(dá)蛋白。

　　1.2.7重組蛋白（rAKP）的純化采用Ni-AgaroseHis標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。對(duì)洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。

　　1.2.8重組蛋白（rAKP）的活性分析采用對(duì)硝基酚磷酸（pNPP）法測(cè)定rAKP的活性。取發(fā)酵菌體超聲破碎后的上清液，加入測(cè)活液，30℃反應(yīng)10min，加入終止液終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)410nm處測(cè)吸收值。

　　2結(jié)果

　　2.1PCR擴(kuò)增E.coliDH10B成熟肽基因（phoA）

　　PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上分析，可見(jiàn)1.4kb的條帶（圖1）大小與預(yù)期一致。

　　1.DNAMarker；2.PCR產(chǎn)物

　　圖1E.coliDH10BphoAmPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

　　2.2重組蛋白（rAKP）的表達(dá)與檢測(cè)

　　重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，取超聲破碎后的上清液，分別用免疫金層析法快速檢測(cè)6×His標(biāo)簽（圖2），用SDS-PAGE法檢測(cè)表達(dá)蛋白（圖3）。rAKP的分子量約為47K。

　　1：陰性對(duì)照；2：rAKP（含6×His標(biāo)簽）

　　圖2免疫金層析法快速檢測(cè)His標(biāo)簽蛋白

　　從左至右分別為誘導(dǎo)0、2、4h；第4泳道為蛋白質(zhì)分子量Marker

　　圖3SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的rAKP

　　2.3重組蛋白（rAKP）的活性分析

　　rAKP經(jīng)活性分析，對(duì)照菌E.coliBL21（DE3）的OD405nm為0.120，重組菌E.coliBL21（DE3）/phoAm的OD405nm為2.58，即重組菌的堿性磷酸酶活性提高21.5倍。

　　3討論

　　本研究首次從E.coliDH10B菌株的基因組中克隆了堿性磷酸酶成熟肽基因，并進(jìn)行了表達(dá)、純化與活性研究。E.coliAKP作為工具酶在表位連鎖、組織化學(xué)、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應(yīng)用。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的AKP產(chǎn)品有蝦堿性磷酸酶（SAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP），其中CIAP的活性最高，約為天然E.coliAKP的40倍[3]。與天然提純的SAP和CIAP相比，E.coliAKP的生產(chǎn)成本低，熱穩(wěn)定性好。由于AKP的構(gòu)效關(guān)系明確，且在定點(diǎn)誘變和結(jié)構(gòu)改造方面積累了一定的經(jīng)驗(yàn)[4-5]。進(jìn)一步研究可結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬對(duì)E.coliAKP的三維結(jié)構(gòu)與催化活性之間的關(guān)系進(jìn)行深入分析[6]，利用當(dāng)前蛋白質(zhì)工程的先進(jìn)技術(shù)手段對(duì)重組E.coliAKP進(jìn)一步改構(gòu)。