基于四象限液晶器件的差分相襯成像系統(tǒng)

在顯微成像領(lǐng)域中，由于無色生物樣本的振幅吸收率低，常規(guī)顯微鏡觀測(cè)下，成像對(duì)比度很低，傳統(tǒng)方法多采用對(duì)其染色的方法使其在顯微鏡下被觀測(cè)。然而對(duì)于生物樣本，化學(xué)染色方式使得生物樣本失活，對(duì)生物樣本進(jìn)行熒光染色時(shí)，所采用的激光照明的方式又會(huì)不可避免地產(chǎn)生光毒性［1］，對(duì)生物樣本有損傷，難以對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的觀測(cè)。因此，無標(biāo)記的相位成像方法成為了生物觀測(cè)中逐漸采用的方式，并在近年來蓬勃發(fā)展［2-3］。相襯顯微鏡和微分干涉顯微鏡［4］的出現(xiàn)為人們觀測(cè)細(xì)胞提供了新的方式。根據(jù)光的干涉以及衍射將樣品的折射率信息即相位差轉(zhuǎn)換為振幅差，實(shí)現(xiàn)了無需標(biāo)記的無色透明樣品觀測(cè)。為了更進(jìn)一步提升成像性能，1984年Hamilton首次提出了差分相襯成像方法［5］，通過將分離式探測(cè)器與掃描式顯微成像系統(tǒng)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品三維信息的定性觀察。2014年Guo等人提出使用液晶顯示器件作為空間光調(diào)制器［6］，實(shí)現(xiàn)了顯微鏡的多模態(tài)成像功能。2015年，Tian等［7］通過將LED陣列作為照明調(diào)控模塊，提出了定量的差分相襯成像方法。同年Zuo等人［8］通過對(duì)現(xiàn)有倒置顯微鏡進(jìn)行優(yōu)化，在顯微成像系統(tǒng)中外接一個(gè)4F系統(tǒng)，在4F系統(tǒng)中兩透鏡的共焦平面放置一款商用LCD顯示屏進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了差分相襯成像等多種成像模式。然而在實(shí)際場(chǎng)景下，商用LCD的顯示器尺寸大，對(duì)于一般的顯微鏡成像系統(tǒng)，聚光鏡后焦面位于機(jī)械可調(diào)光闌處，難以將商用LCD器件放在聚光鏡后焦面處。并且商用LCD因其結(jié)構(gòu)存在黑矩陣遮光膜，導(dǎo)致其對(duì)光的透過率低，其彩色濾光膜也會(huì)進(jìn)一步影響透過率。對(duì)于差分相襯成像系統(tǒng)來說，這幾種因素會(huì)影響系統(tǒng)成像性能的進(jìn)一步提升。

為了實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞觀測(cè)系統(tǒng)的小型化、集成化、高對(duì)比度、低成本需求，貼近差分相襯成像的應(yīng)用場(chǎng)景，本文提出了一種可調(diào)控的顯微鏡聚光鏡模塊，目前在商用顯微鏡OLYMPUS CX23上進(jìn)行優(yōu)化改裝，所設(shè)計(jì)使用的四象限液晶器件尺寸僅為22 mm×18 mm，可嵌入于顯微鏡聚光透鏡的前焦平面處。

2 成像模型與理論

2.1　成像系統(tǒng)的構(gòu)成

圖1為基于四象限液晶器件的差分相襯成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖。它由相機(jī)、成像透鏡、物鏡、載物平面、聚光鏡、四象限液晶器件以及光源組成。系統(tǒng)由一款商用顯微鏡OLYMPUS CX23改裝而成，將小型的四象限液晶器件嵌入放置在聚光透鏡的前焦平面處。

圖1  液晶差分相襯成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

Fig.1  Structure diagram of liquid crystal differential phase contrast imaging system

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2.2　定量差分相襯成像算法原理

定義薄樣品為一個(gè)純相位物體：

o(r)=ei?(r)

 ， （1）

其中：r=(x,y)為樣品平面的空間坐標(biāo)，?(r)為樣品的相位。采用弱相位近似下［9-10］，

o(r)≈1+i?(r)

 . （2）

在某一角度的照明下，樣品平面上的復(fù)函數(shù)為照明函數(shù)Sj(r)與樣品的透過率函數(shù)o(r)的乘積，其中j代表某個(gè)方向的照明，系統(tǒng)的光瞳函數(shù)P(u)由顯微物鏡的數(shù)值孔徑（NA）決定，P(u)=NA/λ。當(dāng)系統(tǒng)的光瞳函數(shù)P(u)已知時(shí)，相機(jī)上采集到的強(qiáng)度譜為：

I(uj)=S(uj)δ(u)|P(uj)|2+iS(uj)?(u)×[P*(uj)P(u+uj)?P(uj)P*(u?uj)] .

（3）

為了線性化地恢復(fù)樣品的相位信息，忽略計(jì)算過程中的二次交叉項(xiàng)［11］。在正常照明情況下，照射到樣品平面上的光源是空間部分相干光，那么強(qiáng)度譜I(u)為多個(gè)角度照明下采集到的強(qiáng)度譜的和：

I(u)=Bδ(u)+iΦ(u)PTF(u)

 ， （4）

式中B代表背景項(xiàng)：

B=?S(uj)|P(uj)|2d2uj

 . （5）

系統(tǒng)的相位傳遞函數(shù)PTF為：

PTF(u)=?S(uj)[P*(uj)P(u+uj)?P(uj)P*(u?uj)]d2uj

 . （6）

我們使用兩個(gè)正交軸上的4張非對(duì)稱照明下采集到的圖像，計(jì)算樣本的相位對(duì)比圖像［5，12］：

IDPClr=Il?IrIl+Ir

 . （7）

Il和Ir代表左半圓和右半圓照明時(shí)采集到的圖像，IDPClr為樣品在上下方向上的相位對(duì)比圖，此時(shí)相位傳遞函數(shù)為：

F(Il?Ir)=iΦ(u)[PTFl(u)?PTFr(u)]

    ， （8）

F(Il+Ir)=(Bl+Br)δ(u)

 . （9）

對(duì)式（7）傅里葉變換，結(jié)合式（8）、（9）得到差分情況下其強(qiáng)度譜為：

IDPClr(u)=iΦ(u)PTFlr(u)Bl+Br

 . （10）

更新后差分情況下的相位傳遞函數(shù)整合為：

PTFDPClr(u)=?Slr(uj)[P*(uj)P(u+uj)?P(uj)P*(u?uj)]d2uj?Slr(uj)|P(uj)|2d2uj

. （11）

這里的Slr(uj)是左半圓照明減去右半圓照明后的照明強(qiáng)度分布。最后通過反卷積和Tikhonov正則化，解算出樣品的定量相位［10］：

?(r)=F?1?????????∑k[PTFDPC*k(u)?   IDPCk(u)]∑k∣∣PTFDPCk(u)∣∣2+α?????????

     . （12）

式中：PTFDPC*k(u)為相位傳遞函數(shù)在不同軸向上的共軛，k代表水平方向或者豎直方向的軸向，α為穩(wěn)定卷積和防止噪聲放大的正則化參數(shù)。

2.3　液晶器件的設(shè)計(jì)

圖2（a）給出了四象限液晶器件的實(shí)物圖，中間小型的為所制作的液晶器件，通過外側(cè)轉(zhuǎn)接件固定到聚光鏡上，紅框中器件顯示的是兩個(gè)象限通光，兩個(gè)象限不通光的效果。圖2（b）所示為所制作的液晶器件被均分為４個(gè)象限。四象限液晶器件在本文搭建的系統(tǒng)中相當(dāng)于一個(gè)開關(guān)作用，每一次獲取圖像時(shí)僅有半圓形狀的兩個(gè)象限通光如圖2（c）所示。

圖2  本研究使用的液晶器件

Fig.2  Liquid crystal devices used in this study

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根據(jù)差分相襯成像的照明調(diào)制需求，研究扭曲液晶器件的透過率特性以及響應(yīng)速度特性，設(shè)計(jì)并制作扭曲液晶器件。扭曲液晶器件的透過率T與器件的調(diào)制量u的關(guān)系式如式（13）所示［13］：

T=1?sin2[θ1+u2?????√]1+u2

 ， （13）

式中：T為液晶器件的透過率，θ為扭曲角度， u=2Δnd/λ，Δn為液晶的折射率各向異性，d為液晶器件的液晶層厚度，λ為照明光波長(zhǎng)，對(duì)于本文使用的TN型液晶器件，θ=90°。透過率曲線如圖3所示，定義第一個(gè)使得透過率T為1時(shí)的調(diào)制量為第一極值點(diǎn)，m代表第幾極值點(diǎn)，m與調(diào)制量u的關(guān)系式如式（14）所示：

u=4m2?1???????√

， （14）

圖3  液晶器件透過率與調(diào)制量關(guān)系圖

Fig.3  Relationship between transmissivity and modulation of liquid crystal device

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液晶器件的響應(yīng)時(shí)間定義為加電時(shí)和斷電時(shí)透光率變化10%所需要的時(shí)間，前者為上升時(shí)間，后者為下降時(shí)間，分別用τon和τoff來表示［13］：

τon=η?   d2ΔεV2?π2k

， （15）

τoff=η?   d2π2k

， （16）

式中：η為黏度，k為彈性系數(shù)，d為液晶器件厚度，Δε為介電各向異性，V為外加電壓。響應(yīng)時(shí)間主要與液晶器件的厚度有關(guān)，結(jié)合器件的透過率特性進(jìn)行參數(shù)設(shè)計(jì)，本文設(shè)計(jì)的扭曲液晶器件根據(jù)透過率為1時(shí)的第一極值點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，即m=1。當(dāng)采用第二或者第三極值點(diǎn)時(shí)，所需要的調(diào)制量u也增大，液晶盒厚d增加，使液晶器件的響應(yīng)時(shí)間變長(zhǎng)。在照明光波長(zhǎng)為550 nm的情況下，計(jì)算得到液晶器件的Δn為0.11，器件厚度為4 μm。

圖4為實(shí)驗(yàn)測(cè)得的相對(duì)光透過率和時(shí)間的曲線，經(jīng)計(jì)算得到實(shí)測(cè)的器件的總響應(yīng)時(shí)間為21 ms。測(cè)量器件亮態(tài)和暗態(tài)的消光比達(dá)到350∶1。

圖4  實(shí)驗(yàn)測(cè)得相對(duì)透過率與時(shí)間曲線

Fig.4  Relative transmittance versus time curve measured experimentally

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液晶器件嵌入顯微鏡聚光鏡模塊的前焦平面處，由于聚光鏡模塊的空間限制，前焦平面的空余區(qū)域?yàn)橹睆綖?0 mm的圓形區(qū)域，液晶器件通過轉(zhuǎn)接嵌入聚光鏡前焦平面鏡處，因此液晶器件的尺寸定為22 mm×18 mm，其中通光區(qū)域的大小為16 mm×16 mm，可以提供匹配40x物鏡的照明NA。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)搭建在商用顯微鏡OLYMPUS CX23上，將設(shè)計(jì)制作的小型扭曲液晶器件通過轉(zhuǎn)接件安置于顯微鏡聚光透鏡的后焦面處。

3.1　微凸透鏡陣列成像實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證所搭建系統(tǒng)的成像性能，我們對(duì)微凸透鏡陣列進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。物鏡放大倍率為20×，0.4 NA。使用微透鏡陣列的參數(shù)為單個(gè)截面尺寸為288 μm，曲率半徑為9 764 μm，根據(jù)幾何關(guān)系計(jì)算出微透鏡陣列的厚度約為1 061 μm。空氣介質(zhì)的折射率參數(shù)nd=1，微透鏡陣列的折射率為nm=1.46。

對(duì)微凸透鏡陣列進(jìn)行定量相位重建實(shí)驗(yàn)，解算獲得的定量相位圖像如圖5所示。

圖5  解算出的微透鏡陣列相位圖

Fig.5  Calculated phase diagram of microlens array

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為了量化相位重建的效果，我們繪制了單個(gè)微透鏡某一方向上的相位變化曲線并與理論曲線進(jìn)行對(duì)比，如圖6所示。

圖6  理論曲線與實(shí)驗(yàn)測(cè)得曲線對(duì)比

Fig.6  Comparison between theoretical curve and experimental curve

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理論計(jì)算經(jīng)過微透鏡陣列的相位差為［14］：

Δ?=2πd(nm?nd)λ

. （17）

理論計(jì)算經(jīng)過微透鏡陣列的最大相位差為5.71 rad，實(shí)驗(yàn)測(cè)得為5.60 rad，與理論值差2%，結(jié)果展現(xiàn)了98%的準(zhǔn)確率。

皮爾遜相關(guān)系數(shù)是衡量曲線相似度的一種方式，輸出范圍為-1~+1，其中0代表無相關(guān)性，負(fù)值代表負(fù)相關(guān)，正值代表正相關(guān)。

Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算方式如式（18）所示：

ρ(A,B)=1N?1∑i=1N(Ai?μAσA)(Bi?μBσB)

 . （18）

我們對(duì)實(shí)驗(yàn)解得的微透鏡陣列的相位圖像中單個(gè)微透鏡的某一方向上的相位差值曲線與理論曲線進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算，得到相關(guān)系數(shù)為0.994 7，結(jié)果表明了系統(tǒng)定量相位成像的高精確度。

3.2　胚胎干細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

驗(yàn)證了系統(tǒng)的定量相位成像能力后，我們對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行了定量相位重建實(shí)驗(yàn)，成像效果如圖7所示。在普通明場(chǎng)顯微鏡情況下，未染色的生物細(xì)胞的光學(xué)吸收系數(shù)低，我們難以觀測(cè)到胚胎干細(xì)胞的有效信息，但在相位圖像中，可以清楚看到胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及其中的線粒體等微觀結(jié)構(gòu)。

圖7  胚胎干細(xì)胞明場(chǎng)圖像和重建相位圖像

Fig.7  Embryonic stem cell bright field image and reconstruction phase image

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4 結(jié)論

本文提出了一種可調(diào)控的顯微鏡聚光鏡模塊，根據(jù)差分相襯成像的照明調(diào)制需求設(shè)計(jì)了聚光鏡模塊中的小型液晶器件進(jìn)行調(diào)控，所設(shè)計(jì)的器件尺寸為22 mm×18 mm，對(duì)比度達(dá)到350∶1，響應(yīng)速度為21 ms。通過微凸透鏡陣列的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了根據(jù)該模塊搭建的系統(tǒng)的定量相位成像性能，胚胎干細(xì)胞成像效果進(jìn)一步體現(xiàn)了本文在實(shí)際場(chǎng)景中的應(yīng)用效果。本文所設(shè)計(jì)的液晶器件只是初步的應(yīng)用嘗試，未來可以通過選擇其他參數(shù)液晶材料進(jìn)行設(shè)計(jì)，如快速響應(yīng)液晶，制作出對(duì)比度更高，響應(yīng)速度更快的液晶器件，為未來實(shí)現(xiàn)高成像速度的實(shí)時(shí)活體成像系統(tǒng)打下良好的基礎(chǔ)。